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Deux isoformes d'amide hydrolase d'acides gras de légumineuses avec des préférences distinctes pour les microbes
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Deux isoformes d'amide hydrolase d'acides gras de légumineuses avec des préférences distinctes pour les microbes

Sep 24, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7486 (2023) Citer cet article

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L'hydrolase d'amide d'acide gras (FAAH) est une amidase largement conservée chez les eucaryotes, peut-être mieux connue pour inactiver les médiateurs lipidiques N-acyléthanolamine. Cependant, les enzymes FAAH hydrolysent une large gamme de substrats d'acylamide. L'analyse des FAAH de plusieurs espèces d'angiospermes a révélé deux groupes phylogénétiques conservés qui différaient par les principaux résidus conservés dans la poche de liaison au substrat. Alors que le groupe fondateur des FAAH végétaux, désigné FAAH1, a été étudié au niveau structurel et fonctionnel chez Arabidopsis thaliana, on ne sait rien des membres FAAH2. Ici, nous avons combiné des approches informatiques et biochimiques pour comparer les propriétés structurelles et enzymatiques de deux isoformes FAAH dans la légumineuse Medicago truncatula désignée MtFAAH1 et MtFAAH2a. Les différences dans les propriétés structurelles et physicochimiques des poches de liaison au substrat, prédites à partir d'expériences de modélisation d'homologie, d'amarrage moléculaire et de simulation de dynamique moléculaire, suggèrent que ces deux isoformes FAAH présenteraient des différences dans leurs profils d'activité amidohydrolase. En effet, des études cinétiques de MtFAAH recombinants purifiés ont indiqué une préférence réciproque pour les substrats d'acylamide avec MtFAAH1 utilisant plus efficacement les acylamides à longue chaîne et MtFAAH2a hydrolysant plus efficacement les acylamides à chaîne courte et aromatiques. Ce premier rapport sur le comportement enzymatique de deux FAAH végétales phylogénétiquement distinctes fournira une base pour d'autres investigations concernant les isoformes de FAAH dans les légumineuses et d'autres espèces végétales.

L'hydrolase d'amide d'acide gras (FAAH) est une amidase conservée qui hydrolyse les N-acyléthanolamines lipophiles (NAE) en éthanolamine et en acides gras libres1,2,3,4. Par exemple; les FAAH du rat, de la souris et de l'homme hydrolysent l'anandamide endogène (NAE20:4) en acide arachidonique et en éthanolamine5,6. Chez les mammifères, ce processus est lié à une variété de processus neurologiques et physiologiques allant de la perception de la douleur à la régulation de l'alimentation7,8. Dans un autre exemple, le FAAH recombinant dérivé de la mousse végétale, Physcomitrella patens, était également capable d'hydrolyser NAE20:4 en produits correspondants, qui semblaient être associés à la croissance et au développement de l'espèce de mousse9. Ailleurs, il a été démontré que C. elegans possède une enzyme FAAH qui métabolise NAE20:4 à l'appui de la régulation de la longévité10. Ces rapports, ainsi que de nombreux autres, ont démontré une machinerie FAAH largement conservée sur plusieurs espèces pour la régulation de la NAE dans divers processus biologiques.

Dans la plante modèle, Arabidopsis thaliana, des études in vitro et in vivo ont montré qu'A. thaliana FAAH (AtFAAH) peut cliver la liaison amide des NAE endogènes, y compris saturés (par exemple NAE12: 0), monosaturés (par exemple NAE18: 1), et les espèces polyinsaturées (par exemple NAE18:3), ainsi que les oxylipines NAE dérivées de 9-LOX (9-hydroxy linoléoyléthanolamide ; NAE-9-HOD)1,11,12,13. La régulation de la teneur en NAE par FAAH semble être associée à une variété de processus biologiques14. Par exemple, chez Arabidopsis, les lignées surexprimant AtFAAH avaient des quantités plus faibles de NAE endogènes et présentaient des différences accrues dans la croissance des semis15, le temps de floraison16 et l'immunité innée17, par rapport aux plantes de type sauvage. En revanche, les knock-out d'Arabidopsis faah avaient des teneurs élevées en NAE endogènes et étaient hypersensibles à l'inhibition de la croissance induite par des applications externes avec des NAE (par exemple NAE12:0 ou NAE18:2)15,18,19, alcamides20,21, N-acyl homosérine lactones (AHL)22, ou la phytohormone ABA13. Dans un autre rapport, des semis de coton upland (Gossypium hirsutum L.) présentant une surexpression ectopique d'AtFAAH ont montré une insensibilité à NAE12:0 ou à l'hydroxyde dérivé de NAE18:2 (NAE-9-HOD), ressemblant ainsi aux résultats trouvés chez Arabidopsis23. Ces rapports suggèrent que la régulation de la teneur en N-acyléthanolamide par FAAH peut influencer un certain nombre de processus physiologiques chez les plantes.

Les N-Acyl-ʟ-homosérine lactones (AHL) ou les N-aryl-ʟ-homosérine lactones (aryl-HL) sont des lipides dérivés de bactéries qui sont utilisés dans les processus de communication intercellulaire (détection du quorum ; QS) (par exemple biofilm production) ou des interactions avec un hôte (ex. reconnaissance de bactéries symbiotiques ou pathogènes)24,25,26. En raison des similitudes structurelles entre les NAE et ces molécules QS (groupe de tête polaire avec une queue acyle liée à un amide), il a été émis l'hypothèse que les FAAH végétaux pourraient hydrolyser les AHL et les aryl-HL22. D'autres expériences ont révélé que l'AtFAAH recombinante hydrolyse les AHL à longue chaîne acyle telles que l'OdDHL (N-(3-oxododécanoyl)-ʟ-homosérine lactone) ou l'OtDHL (N-(3-oxotétradécanoyl)-ʟ-homosérine lactone) mieux que les AHL à chaînes plus courtes. comme OHHL (N-(3-oxohexanoyl)-ʟ-homosérine lactone)22, indiquant ainsi que l'activité AtFAAH peut être influencée par la longueur/nature de la chaîne acyle dans le substrat. Dans la même expérience, l'aryl-HL, p-coumaryl-HL était un mauvais substrat pour AtFAAH22. En outre, il a été démontré que les AHL déclenchent une réponse de croissance «biphasique» chez les semis d'A. thaliana. Dans leurs expériences, des semis d'Arabidopsis de type sauvage nourris avec des AHL ont présenté des phénotypes de croissance améliorés ou réduits à des concentrations d'AHL faibles (par exemple 0,1 µM) ou élevées (par exemple 100 µM), respectivement22. Ensuite, des comparaisons côte à côte avec des knock-outs faah d'Arabidopsis ont révélé qu'une telle sensibilité peut être modulée de manière dépendante de FAAH, c'est-à-dire que l'hydrolyse des AHL par FAAH était nécessaire pour la modulation du signal de croissance22.

Les alcamides sont des amides d'acides gras d'origine fongique ou végétale21,27,28 et constituent un autre groupe de molécules de type NAE qui ont été associées à l'hydrolyse médiée par FAAH20. Chez Arabidopsis de type sauvage, des applications exogènes de l'alkamide, de l'affinine (groupe de tête N-isobutyle et chaîne acyle) ont entraîné un effet "biphasique" qui ressemblait à celui des AHL (voir ci-dessus). En effet, les semis de type sauvage d'Arabidopsis nourris avec de l'affinine à des concentrations inférieures à 28 µM avaient des racines primaires plus longues que les témoins21. À l'inverse, l'affinine à des concentrations supérieures à 28 µM a entraîné un développement racinaire nettement altéré21. Dans une autre étude, les surexpressions de FAAH d'Arabidopsis ou les knock-outs de faah ont démontré que la sensibilité aux alkamides était modulée via l'hydrolyse de FAAH20. Fait intéressant, l'activité AtFAAH in vitro vis-à-vis de l'affinine ou d'autres 12 alcamides de différentes longueurs de chaîne acyle et groupes de tête alkyle était bien inférieure à celle de l'hydrolyse AtFAAH des NAE20. Néanmoins, ces rapports soutiennent un lien entre l'hydrolyse FAAH des alcamides et les effets sur la croissance des plantes.

La FAAH est caractérisée par la présence d'une triade catalytique conservée Ser-Ser-Lys1,29,30. Les N-acylamides qui atteignent le site actif au niveau du canal de liaison acyle (ABC) forment un intermédiaire covalent entre le substrat et l'enzyme. Ceci est réalisé par l'activation de la sérine catalytique (nucléophile) qui attaque le carbone du groupe carbonyle dans le substrat31. Les FAAH de mammifères et de plantes semblaient avoir des mécanismes distincts pour la liaison au substrat. Par exemple, AtFAAH est proposé de subir des changements conformationnels qui conduisent au mouvement d'une région d'hélice (résidus 531-537) et à la fermeture de son canal d'accès à la membrane (MAC), par un processus appelé "squeeze and lock"1. En revanche, dans la FAAH du rat, le complexe ligand-enzyme est sécurisé par une "palette dynamique" qui ferme son MAC plus étroit et "piége" le substrat dans le site actif. Dans les deux cas, après la catalyse FAAH, l'éthanolamine est libérée dans le cytosol via le canal d'accès cytosolique (CAC) tandis que le produit d'acide gras est relâché dans l'environnement hydrophobe de la bicouche membranaire1,29. Les structures cristallines résolues des FAAH végétales et mammifères ont fourni des informations sur les composants structurels et fonctionnels clés qui pourraient être utilisés comme référence pour les FAAH d'autres organismes.

Récemment, la comparaison de 88 séquences d'acides aminés FAAH de diverses espèces d'angiospermes a révélé deux groupes phylogénétiques majeurs, FAAH1 et FAAH232. Les espèces végétales de la famille Brassica telles que A. thaliana ou Camelina sativa ne présentaient qu'une seule isoforme FAAH (FAAH1) alors que toutes les espèces dicotylédones et monocotylédones, y compris Amborella trichopoda (l '«espèce ancestrale d'angiospermes») avaient les deux groupes FAAH, et beaucoup avaient plus de un membre32. Par exemple, la tomate (Solanum tuberosum) a trois isoformes FAAH1 et une FAAH2, tandis que le riz (Oryza sativa) a une FAAH1 et deux isoformes FAAH232. L'analyse des alignements de séquences multiples a montré des changements de résidus dans les régions correspondant à la poche de liaison au substrat des isoformes FAAH1 et FAAH2. La modélisation de l'homologie des FAAH du soja (Glycine max) a révélé des différences structurelles et chimiques supplémentaires entre le FAAH1 et le FAAH232 du soja. Ces différences ont été supposées influencer la sélectivité du substrat des enzymes FAAH1 et FAAH2, et suggèrent en outre que les FAAH peuvent avoir développé des machineries FAAH distinctes pour moduler un répertoire élargi de lipides de signalisation lipophiles. Bien que conceptuellement cette notion semble plausible, jusqu'à présent, les preuves expérimentales pour étayer cette hypothèse font défaut, en grande partie parce qu'il n'y a pas d'informations biochimiques liées au groupe d'enzymes FAAH2. Ici, nous comblons cette lacune dans les connaissances en combinant des approches informatiques et biochimiques pour étudier et caractériser deux FAAH de la légumineuse Medicago truncatula, MtFAAH1 et MtFAAH2a, et fournir des preuves que ces deux isoformes ont des préférences de substrat réciproques.

Pour examiner la diversité FAAH dans les légumineuses, nous avons comparé les séquences d'acides aminés FAAH de dix espèces sélectionnées en utilisant AtFAAH (une enzyme FAAH1) comme référence (Fig. 1a; Tableau supplémentaire S1). Les données ont montré que ces FAAH de légumineuses se regroupaient en deux groupes principaux, désignés FAAH1 et FAAH2 (Fig. 1a). Une seule isoforme FAAH1 a été identifiée dans chaque espèce de légumineuse. Notamment, FAAH2 a formé deux sous-groupes dans la plupart des espèces, FAAH2a et FAAH2b. À l'exception de G. max et Vigna radiata, le reste des légumineuses (y compris M. truncatula) avait deux isoformes FAAH2. Par rapport au membre fondateur de FAAH1, AtFAAH, les pourcentages de similarité de séquence d'acides aminés pour MtFAAH1, MtFAAH2a ou MtFAAH2b étaient d'environ 66%, 44% et 44%, respectivement (Fig. S1 supplémentaire; Tableau supplémentaire S2).

Analyse des séquences et des modèles d'homologie des FAAH de Medicago truncatula, à savoir MtFAAH1 et MtFAAH2a. ( a ) Analyse phylogénétique des séquences d'acides aminés des FAAH de 10 espèces de légumineuses différentes. La séquence FAAH (AtFAAH) d'A. thaliana a également été incluse dans l'analyse, en tant que témoin FAAH1. Les astérisques désignent les séquences MtFAAH qui ont été étudiées plus en détail dans cette étude. ( b ) Modèles d'homologie de MtFAAH1 et MtFAAH2a (panneau supérieur). Le canal d'accès à la membrane (MAC) et le capuchon de liaison à la membrane (MBC) sont marqués dans les structures. Une vue à 90° des mêmes modèles est incluse (panneau inférieur) à des fins de visualisation. Le domaine de signature amidase (AS) de AtFAAH (violet) a été superposé avec le (c) AS de MtFAAH1 (vert) ou (d) l'AS de MtFAAH2a (jaune). Une vue rapprochée de leurs résidus de triade catalytique est présentée pour (c) et (d).

L'inspection des profils d'expression des transcrits de MtFAAH1, MtFAAH2a et MtFAAH2b dans le Medicago truncatula Gene Expression Atlas "MtExpress"34 a montré que MtFAAH1 ou MtFAAH2a étaient fortement exprimés dans différents tissus, conditions de température, points de temps, stress abiotiques (par exemple N-famine) et stress biotiques (par exemple, exposition au champignon mycorhizien à arbuscules Rhizophagus irregulis) alors que dans les mêmes conditions, MtFAAH2b était exprimé à un niveau beaucoup plus faible (Fig. S2 supplémentaire). Sur la base de ces données, nous avons sélectionné MtFAAH1 et MtFAAH2a pour une analyse plus approfondie avec des approches informatiques et biochimiques.

Des modèles d'homologie de MtFAAH1 et MtFAAH2a ont été prédits sur la base de la structure cristalline de AtFAAH (PBD: 6DHV) pour comparer leurs caractéristiques structurelles (Fig. 1b). La qualité des modèles MtFAAH1 et MtFAAH2a a été étayée par des scores GMQE (Global Model Quality Estimate) (0,90 pour MtFAAH1 et 0,80 pour MtFAAH2a), des scores QMEANDisCo (Qmean consensus-based distance strain) (0,88 pour MtFAAH1 et 0,79 pour MtFAAH2a), et Scores de Ramachandran (Ramachandran favorisé ; 95,59 % pour MtFAAH1 et 94,31 % pour MtFAAH2a) (Figs supplémentaires. S3, S4 ; Tableau supplémentaire S3, S4). Les deux modèles sont présentés sous forme d'homodimères (Fig. 1b) avec un contenu global prédit et une organisation similaires des hélices alpha, des feuillets bêta, des spires et des bobines non structurées (Fig. S5 supplémentaire). MtFAAH1 et MtFAAH2a ont conservé des capuchons de liaison à la membrane (MBC) et des canaux d'accès à la membrane (MAC) à leurs extrémités N (Fig. 1b, Fig. S6 supplémentaire), qui devraient ancrer FAAH à la membrane1. Comme dans la structure cristalline AtFAAH, les MBC des deux MtFAAH sont caractérisés par une prévalence de résidus hydrophobes (Fig. S6 supplémentaire). Comme prévu, le domaine de signature amidase (AS) de AtFAAH est caractérisé par la présence d'une triade catalytique Ser-Ser-Lys comme dans d'autres membres de la famille FAAH, et ces résidus sont conservés ici dans MtFAAH1 et MtFAAH2a (Fig. 1c, d) . Dans l'ensemble, ces données mettent en évidence la conservation de l'association membranaire prédite et des résidus de sites actifs pour MtFAAH1 et MtFAAH2a.

Auparavant, un rapport avait mis en évidence plusieurs différences de résidus clés qui altéraient la forme et les propriétés prévues des poches de liaison au substrat (SBP) du soja FAAH1 et FAAH232. Afin de corroborer que ces résultats sont conservés dans une espèce de légumineuse différente, nous avons analysé les SBP des FAAH de M. truncatula, MtFAAH1 et MtFAAH2a. Les données ont révélé de multiples différences de résidus, en particulier dans les canaux d'accès cytosolique (CAC) et de liaison acyle (ABC) (Fig. 2; Tableau supplémentaire S5). Le CAC de MtFAAH1 a plusieurs polaires (par exemple Thr299, Glu337) alors que ces résidus dans le CAC de MtFAAH2a sont des acides aminés non polaires (par exemple Val306, Trp341) (Fig. 2a – e). De plus, MtFAAH1 a positionné le résidu le moins volumineux, Gly334 dans son CAC, ce qui semble fournir une cavité plus ouverte par rapport à celle de son homologue FAAH2 (Fig. 2a – e). Inversement, MtFAAH2a a le grand résidu aromatique, Trp341 dans son CAC, ce qui se traduit par un CAC plus restrictif (Fig. 2a – e). L'ABC de MtFAAH1 est caractérisé par des résidus non polaires/hydrophobes tels que Leu441, Phe475, Met531 alors que dans MtFAAH2a ces résidus ont été remplacés par trois résidus tyrosine (Tyr444, Tyr477 et Tyr533) qui fournissent des environnements plus neutres, polaires et aromatiques (Fig. 2a–e). De plus, les résidus de tyrosine dans MtFAAH2a ont donné un ABC plus fermé et plus court (Fig. 2a – e). En revanche, les résidus de MtFAAH1 ont donné un ABC plus ouvert, comme le montrent leurs profils de surface aromatiques et hydrophobes (Fig. 2d, e) plus similaires à l'ACB de AtFAAH11. Notamment, plusieurs des résidus trouvés dans les SBP de MtFAAH1 ou MtFAAH2 sont conservés parmi les groupes FAAH1 ou FAAH2 de plusieurs espèces de légumineuses (Fig. S7 supplémentaire). Ensemble, ces données suggèrent que MtFAAH1 et MtFAAH2a ont des propriétés structurelles et physiochimiques distinctes dans leurs SBP. Par conséquent, ces différents SBP sont susceptibles d'accueillir différentes structures d'acylamide.

Les poches de liaison au substrat (SBP) de MtFAAH1 et MtFAAH2a révèlent différents profils structurels et physicochimiques. Les résidus prévus différents dans les SBP de (a) MtFAAH1 (bâtons de couleur cyan) ou (b) MtFAAH2a (bâtons de couleur orange) sont affichés. La liste complète des résidus qui devraient former les SBP des deux MtFAAH se trouve dans le tableau supplémentaire S3. ( c ) Alignement partiel entre les séquences d'acides aminés MtFAAH1 et MtFAAH2a. Les flèches pointant vers les résidus dans les polices cyan ou orange représentent des résidus distincts dans le SBP de MtFAAH1 ou MtFAAH2a, respectivement. (d) Les surfaces aromatiques des résidus mis en évidence en (a), (b) et (c) révèlent différents profils aromatiques. L'échelle aromatique décrit les conformations bord (bleu) à face (orange) des résidus avec une chaîne latérale aromatique. ( e ) Profils de surface d'hydrophobicité pour les résidus mis en évidence dans ( a ), ( b ) et ( c ). L'échelle d'hydrophobicité varie de 3,00 pour les régions hydrophobes les plus élevées (marron) ou -3,00 pour les régions hydrophobes les plus basses (bleu).

Pour tester comment les différences dans les SBP de MtFAAH1 et MtFAAH2a pourraient modifier la liaison et l'accommodation du substrat, nous avons effectué des expériences d'amarrage moléculaire (Fig. 3). Pour stabiliser géométriquement MtFAAH1 et MtFAAH2a avant les expériences d'amarrage, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire (MDS) des formes apo de MtFAAH1 et MtFAAH2a pendant 100 ns. Les trajectoires MD résultantes ont été étudiées via les calculs Root-Mean-Square Deviation (RMSD) et Root-Mean-Square-Fluctuation (RMSF). Les deux MtFAAH sont apparus stables tout au long de la simulation avec des valeurs RMSD d'environ 1, 5 à 1, 7 Å pour MtFAAH1 et de 1, 8 à 2, 2 Å pour MtFAAH2a (Fig. S8 supplémentaire). Les valeurs RMSF ont montré des profils de fluctuation similaires pour les deux MtFAAH, à l'exception d'une région de séquence dans MtFAAH2a composée des résidus 366 à 387 où une fluctuation plus élevée a été observée par rapport à MtFAAH1 (Fig. S8 supplémentaire).

Amarrage moléculaire de la sous-unité A de MtFAAH1 ou MtFAAH2a avec différents N-acylamides. Les structures 2D de huit ligands potentiels pour les MtFAAH ont été dessinées à l'aide du logiciel ChemDraw (Molecular Editor) (a). Sur les huit candidats ligands, nous en avons sélectionné trois pour les expériences d'amarrage, à savoir NAE18:2, NAE12:0 et p-coumaryl-HL. Apo MtFAAH1 et MtFAAH2a ont été soumises à des simulations de dynamique moléculaire (MDS) (pendant 100 ns) avant toutes les expériences d'amarrage. Vues plus larges et rapprochées de NAE18: 2 (b, c), NAE12: 0 (d, e) ou p-coumaryl-HL (f, g) ancré dans MtFAAH1 ou MtFAAH2a. Les liaisons covalentes sont représentées par des lignes cyan entre les oxygènes de la chaîne latérale des résidus catalytiques de MtFAAH1 (Ser304) ou MtFAAH2a (Ser311) et le carbone du groupe carbonyle dans les substrats. Les liaisons hydrogène sont affichées sous forme de lignes bleues tandis que les interactions hydrophobes (van der Waals) sont désignées par des lignes pointillées grises entre les atomes en interaction. Les nombres affichés dans les liaisons représentent les distances (Å) entre les points de contact. Abréviations : poche de liaison au substrat (SBP).

Pour les études d'amarrage, trois acylamides structurellement différents (Fig. 3a) ont été comparés - NAE18: 2, NAE12: 0 ou p-coumaryl-HL. Les modèles d'homologie MtFAAH1 ou MtFAAH2a stabilisés par MD ont été ancrés avec ces trois ligands (Fig. 3b – g). L'amarrage a révélé le potentiel de liaisons covalentes entre l'oxygène de la chaîne latérale (Oγ) de Ser304 ou Ser311 et le carbone du groupe carbonyle des substrats avec des distances de liaison allant de 2, 1 à 2, 6 Å. Les groupes de tête éthanolamines polaires des NAE (NAE18: 2 ou NAE12: 0) étaient soutenus par de multiples liaisons hydrogène dans les SBP de MtFAAH1 (Fig. 3b, d) et MtFAAH2a (Fig. 3c, e); cela implique des résidus tels que Gly301, Gly254, Thr299 et Asp206 dans MtFAAH1, et des résidus tels que Gly308 et Gly309 dans MtFAAH2a. L'inspection des MtFAAH liés au p-coumaryl-HL a révélé des similitudes et des différences intéressantes. MtFAAH1 et MtFAAH2a nécessitaient des résidus de glycine (Gly301 pour MtFAAH1 et Gly308 pour MtFAAH2a) pour la liaison hydrogène avec le groupe de tête du p-coumaryl-HL (Fig. 3f, g). Cependant, le groupe de tête d'homosérine lactone (HL) de p-coumaryl-HL était beaucoup plus soutenu dans le SBP de MtFAAH2a avec des liaisons hydrogène supplémentaires médiées par Glu213, Met345 et Val306. De plus, MtFAAH1 a positionné Thr299 pour les interactions de liaison hydrogène avec p-coumaryl -groupe de tête HL alors que MtFAAH2a avait la chaîne latérale aromatique de Trp341 et la boucle pyrrolidine de Pro338 pour les interactions hydrophobes avec la tête HL (Fig. 3f, g). Ces données indiquent une organisation similaire des résidus de la triade catalytique pour réaliser la catalyse et suggèrent des interactions similaires et distinctes pour stabiliser les différentes "régions de tête" polaires des substrats dans les sites actifs des MtFAAH.

L'analyse des interactions entre les chaînes acyles des NAE ou du p-coumaryl-HL et les résidus des SBP des MtFAAH a révélé certaines similitudes et différences. La chaîne acyle de NAE18: 2 est soutenue dans MtFAAH1 par des interactions hydrophobes avec Leu441 et un réseau de trois résidus thréonine (Thr257, Thr258, Thr529). Le positionnement géométrique de ces résidus dans MtFAAH1 semble fournir un environnement flexible pour l'hébergement de longues chaînes acyle (Fig. 3b; Fig. Supplémentaire S9) similaire à celui rapporté pour AtFAAH11. La liaison de NAE18: 2 dans MtFAAH2a a été étayée par des interactions hydrophobes prédites avec Thr264, Ile447, Ile540 et deux résidus tyrosine, Tyr533 et Tyr444 (Fig. 3c). Par rapport à MtFAAH1, la surface de la poche de liaison MtFAAH2a semblait avoir une forme différente pour s'adapter à NAE18: 2 (Fig. 3c; Fig. Supplémentaire S9). Il semble que la chaîne acyle de NAE18: 2 puisse être structurellement plus compressée dans MtFAAH2a, vraisemblablement, pour s'adapter à une SBP de taille plus restrictive dans MtFAAH2a (Fig. 3c; Fig. Supplémentaire S9). La chaîne acyle du NAE le plus court (NAE12: 0) ancré dans MtFAAH1 ou MtFAAH2a est soutenue dans les deux cas par des interactions de van der Waals avec l'acide aminé aliphatique isoleucine (Ile444 pour MtFAAH1 ou Ile540 pour MtFAAH2a) (Fig. 3d, e). De plus, MtFAAH2a a positionné le résidu aromatique tyrosine (Tyr533) pour les interactions aux positions C11 et C12 de la queue NAE12: 0 tandis que MtFAAH1 affiche Leu441 pour les interactions en C10 de la chaîne acyle de NAE (Fig. 3d, e). Contrairement à MtFAAH1, MtFAAH2a semble posséder une surface plus aromatique pour accueillir NAE12: 0 dans son SBP (Fig. 3d, e; Fig. Supplémentaire S9). Enfin, MtFAAH1 accueille le p-coumaryl-HL par les interactions prédites de van der Waals entre Thr257 et la queue aromatique de l'aryl-HL (Fig. 3f) alors que MtFAAH2a, outre les interactions avec des résidus similaires (Ile447), a également positionné un résidu aromatique , Tyr477, pour des liaisons hydrogène supplémentaires et des interactions π-π avec le fragment acyle phénolique du p-coumaryl-HL (Fig. 3g; Fig. S9 supplémentaire). Ces données suggèrent que MtFAAH1 ou MtFAAH2a peuvent accueillir des NAE ou des aryl-HL via des résidus aux propriétés physicochimiques distinctes. En effet, MtFAAH1 semble utiliser généralement des résidus hydrophobes avec des chaînes latérales aliphatiques alors que MtFAAH2a repose systématiquement sur des résidus neutres avec des chaînes latérales aromatiques.

Pour disséquer davantage les résidus et mécanismes supplémentaires qui pourraient être potentiellement impliqués dans l'hébergement des substrats dans les MtFAAH, nous avons effectué une simulation de dynamique moléculaire (MDS) sur MtFAAH1 ou MtFAAH2a ancré avec NAE18: 2 ou p-coumaryl-HL pendant 100 ns (Figs. 4, 5 ; Fig. supplémentaires S10, S11 ; Tableau supplémentaire S6 ; Vidéos supplémentaires 1 à 12). Les trajectoires MDS pour MtFAAH1 et MtFAAH2a ont révélé que NAE18: 2 ou p-coumaryl-HL peuvent être pris en charge par des interactions prédites distinctes.

Simulations de dynamique moléculaire (MDS) de la sous-unité A de MtFAAH1 liée à NAE18:2 (a, c) ou p-coumaryl-HL (b, d). « 0 ns » correspond aux complexes équilibrés (orange), « 10 ns » et « 100 ns » représentent les complexes traités au MDS à 10 (violet) et 100 ns (vert). Vues plus larges et en gros plan des régions d'hélices (résidus 530 à 536) affichées sous forme de dessins animés et de bâtons superposés, poche de liaison au substrat (SBP) avec des ligands (sphères) et des résidus superposés (bâtons) choisis à partir d'expériences d'amarrage et hélices α1 et α2 prédites sont affichés sous forme de dessins animés et de bâtons superposés (a, b). Les nombres affichés dans les liaisons de van der Waals (lignes pointillées jaunes) représentent les distances (Å) entre les points de contact. Vue de surface rapprochée du canal d'accès à la membrane (MAC) de MtFAAH1 lié à NAE18: 2 (c) ou p-coumaryl-HL (d).

Simulations de dynamique moléculaire (MDS) de la sous-unité A de MtFAAH2a liée à NAE18:2 (a, c) ou p-coumaryl-HL (b, d). « 0 ns » correspond aux complexes équilibrés (jaune), « 10 ns » et « 100 ns » représentent les complexes traités au MDS à 10 (bleu) et 100 ns (cyan). Vues plus larges et rapprochées des régions d'hélices (résidus 530 à 536) affichées sous forme de dessins animés et de bâtons superposés, poche de liaison au substrat (SBP) avec ligand (sphères) et résidus superposés (bâtons) choisis à partir d'expériences d'amarrage et hélices α1 et α2 prédites sont affichés sous forme de dessins animés et de bâtons superposés (a, b). Les nombres affichés dans les liaisons de van der Waals (lignes pointillées jaunes) représentent les distances (Å) entre les points de contact. Vue de surface rapprochée du canal d'accès à la membrane (MAC) de MtFAAH1 lié à NAE18: 2 (c) ou p-coumaryl-HL (d).

Dans le SBP de MtFAAH1, NAE18: 2 semble nécessiter l'hébergement de sa chaîne acyle via Thr534 et Met531 (Fig. 4a; Tableau supplémentaire S6, Vidéo supplémentaire S1, S2). Ces résidus se trouvent dans une région en hélice (résidus 530 à 536) connue pour être nécessaire au mécanisme de "compression" et de "verrouillage", comme indiqué pour AtFAAH ailleurs1. À 10 et 100 ns, des interactions de van der Waals ont été observées entre Thr534 et plusieurs carbones de la chaîne acyle de NAE18: 2, à savoir C14 à C16 et C12 à C13, respectivement. De plus, le résidu Met531, situé à l'extrémité de la région de l'hélice, semble être très flexible et pourrait potentiellement former des interactions similaires avec NAE18: 2 en position C10, comme indiqué à 100 ns (Fig. 4a). Une inspection minutieuse au SBP a révélé que la conformation de la queue acyle de NAE18: 2 a changé au fil du temps. En effet, la queue NAE18: 2 était très flexible lors de la simulation, en particulier de C12 à C18, et s'est orientée de C1 à C9 en ligne droite à 100 ns (Fig. 4a; Vidéo supplémentaire S1, S2). Ainsi, suggérant un SBP très flexible adapté à l'hébergement d'amides d'acyle avec de longues chaînes d'acyle. De plus, l'analyse du MAC a révélé un mouvement vers l'intérieur de l'hélice α1 (résidus 51–58). Ce mouvement semble conduire à la fermeture du MAC après la liaison à NAE18: 2 (Fig. 4c), ce qui peut suggérer un mécanisme de "verrouillage" pour confiner le substrat dans la poche de liaison pour la catalyse (Vidéo supplémentaire S3). En revanche, l'analyse de MtFAAH1 lié au p-coumaryl-HL a suggéré que cet aryl-HL est mal adapté dans la SBP de MtFAAH1 avec peu d'interactions potentielles (Fig. 4b; Vidéo supplémentaire S4, S5). En effet, la région de l'hélice (résidus 530-536) ne semble pas du tout interagir avec le substrat p-coumaryl-HL. De plus, des résidus tels que Met531 et Thr534 étaient loin d'interagir avec la queue aromatique du p-coumaryl-HL (Vidéo supplémentaire S5), ce qui suggère que les interactions protéine-ligand dans cette région du SPB sont hautement improbables pour le p-coumaryl. -HL. Enfin, aucun changement spectaculaire n'a été observé ni dans la conformation de la structure p-coumaryl-HL ni dans le mouvement de l'hélice α1 de MtFAAH1 MAC, entraînant un MAC ouvert ou partiellement ouvert au cours de la simulation (Fig. 4b, d ; Vidéo supplémentaire S6).

Contrairement au cas avec MtFAAH1, la région de l'hélice (résidus 532–538) de MtFAAH2a n'a montré aucun mouvement spectaculaire vers le substrat NAE18: 2 lors de la liaison (Fig. 5a; Tableau supplémentaire S6; Vidéo supplémentaire S7, S8). Néanmoins, des interactions de van der Waals ont été trouvées entre Tyr533 et la chaîne acyle de NAE18: 2 en C13 et C16 (10 ns) et en positions C11 et C12 (100 ns) (Fig. 5a). Aucun autre résidu dans cette région ne semblait être impliqué ou en contact étroit avec la chaîne acyle de NAE18:2. De plus, la conformation de la chaîne acyle de NAE18: 2 de C1 à C9 semblait être fortement comprimée et avec peu de mouvements au cours de la simulation. Ce ligand présentait de multiples contorsions à différentes positions de carbone de sa queue à la fin de la simulation (Fig. 5a; Vidéo supplémentaire S7, S8). Différent du SBP plus ouvert de MtFAAH1, NAE18: 2 s'intègre dans le plus petit SBP de MtFAAH2a semble être beaucoup plus limité et restrictif. Un très léger mouvement vers l'extérieur de l'hélice α1 (résidus 52 à 59) a été enregistré au cours de la simulation ; cependant, ce mouvement n'a pas coïncidé avec l'ouverture ou la fermeture du MAC de MtFAAH2a MAC (Fig. 5c; Vidéo supplémentaire S9). La liaison de MtFAAH2a au p-coumaryl-HL a été soutenue par de multiples interactions, y compris le résidu Tyr533 (Fig. 5b; Vidéo supplémentaire S10, S11). Au cours du temps de simulation, il y avait des interactions étroites cohérentes entre ce résidu de tyrosine et la queue aromatique de p-coumaryl-HL. Ces interactions probables π- π pourraient fixer ce ligand en place pour la catalyse (Fig. 5b; Vidéo supplémentaire S11). De plus, nous avons également noté des interactions hydrophobes cohérentes entre l'anneau HL de tête et le résidu Trp341 situé au niveau du canal d'accès cytosolique (CAC) du SBP de MtFAAH2a (Fig. 5b; Vidéo supplémentaire S10). Enfin, bien que de légers déplacements vers l'extérieur aient été détectés dans l'hélice α1 (résidus 52–59) du MAC de MtFAAH2a (Fig. 5b), aucun changement substantiel n'a été trouvé et le MAC est resté dans une conformation fermée pendant la simulation de 100 ns (Fig. 5d ; Vidéo supplémentaire S12).

Au total, ces données suggèrent des moyens distincts pour l'ajustement des substrats d'acyléthanolamide dans les SBP des enzymes MtFAAH1 ou MtFAAH2a. Nos expériences MDS mettent en évidence des résidus potentiels qui pourraient être impliqués dans l'hébergement préférentiel des NAE ou des substrats aryl HL par ces deux isoformes enzymatiques.

Pour tester les différences fonctionnelles entre MtFAAH1 et MtFAAH2, nous avons cloné des MtFAAH (Fig. S12 supplémentaire; Tableau supplémentaire S8) dans des vecteurs d'expression sous forme de fusions marquées His pour la production de protéines recombinantes dans E. coli. Pour purifier les protéines recombinantes, nous avons utilisé des techniques de chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (nickel) (IMAC) et de chromatographie d'exclusion de taille (SEC) (Fig. 6). Nous avons observé des bandes proéminentes à ≈ 70 kDa représentant MtFAAH1 et MtFAAH2a à partir des échantillons purifiés par IMAC et SEC (Fig. 6b, d). Ces bandes étaient équivalentes aux poids moléculaires calculés (MW) des protéines MtFAAHs. Pour évaluer si les états d'oligomérisation de chaque MtFAAH purifié diffèrent de ceux de AtFAAH1, les volumes d'élution des chromatogrammes des normes de filtration sur gel et AtFAAH ont été utilisés comme référence pour les calculs de MtFAAH (Fig. 6a; Fig. Supplémentaire S13). Nous avons observé un volume d'élution moyen de 10,08 ml (à pH 9,0) et de 10,14 ml (à pH 7,5) pour MtFAAH1 et MtFAAH2a, respectivement (Fig. S13 supplémentaire). En solution, le MW de MtFAAH1 a été estimé à ≈ 346 kDa et MtFAAH2a à ≈ 371 kDa (Fig. 6c, e; Fig. Supplémentaire S13). Considérant les poids moléculaires des sous-unités individuelles de MtFAAH1 et MtFAAH2 comme 69,6 ou 70,1 kDa, respectivement (Fig. 6; Fig. Supplémentaire S13), et le poids moléculaire rapporté des micelles DDM comme ≈ 70 kDa35, nous avons estimé que MtFAAH1 et MtFAAH2a étaient chacun purifiés sous forme de tétramères (Fig. S13 supplémentaire). Les gels SDS-PAGE non recadrés / non édités utilisés pour les Fig. 6b, d peuvent être trouvés dans les Figs supplémentaires. S19 et S20, respectivement, tandis que les gels originaux utilisés pour la Fig. S13 supplémentaire peuvent être trouvés dans les Figs supplémentaires. S21–S23.

Purification de Medicago truncatula FAAH1 et FAAH2a. (a) Superdex 200 Augmentation du chromatogramme 10/300 GL des étalons de filtration sur gel : thyroglobuline, 670 kDa ; apoferritine, 481 kDa; γ-globuline, 158 kDa; ovalbumine, 44 kDa; myoglobine, 17 kDa; vitamine B12, 1,35 kDa. ( b ) Gel SDS-PAGE coloré au Coomassie de fractions prélevées lors de la purification de MtFAAH1. Échelle de poids moléculaire (piste M), lysat cellulaire de cellules BL21 (DE3) après sonication (piste 1), débris cellulaires granulés après sonication (piste 2), écoulement à travers la colonne IMAC (piste 3), élution IMAC (piste 4), protéine purifiée par chromatographie d'exclusion stérique (piste 5). ( c ) Superdex 200 Augmenter le chromatogramme 10/300 GL de la purification MtFAAH1. ( d ) Gel SDS-PAGE coloré au Coomassie de fractions prélevées lors de la purification de MtFAAH2a. Échelle de poids moléculaire (piste M), lysat cellulaire de cellules BL21 (DE3) après sonication (piste 1), débris cellulaires granulés après sonication (piste 2), écoulement à travers la colonne d'affinité au nickel (piste 3), protéine purifiée par affinité au nickel (piste 4), protéine purifiée par chromatographie d'exclusion stérique (piste 5). (e) Superdex 200 Augmenter le chromatogramme 10/300 GL de la purification MtFAAH2a. Les flèches et les crochets pointent vers les fractions purifiées par SEC qui ont été analysées par SDS-PAGE et utilisées pour les dosages d'activité enzymatique. Les gels SDS-PAGE non recadrés / non édités affichés en (b) et (d) peuvent être trouvés dans les Figs supplémentaires. S19 et S20, respectivement.

De plus, nous avons utilisé la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS) pour confirmer l'identité des protéines recombinantes purifiées MtFAAH et AtFAAH (Figs supplémentaires S14, S15, S16). MtFAAH1, MtFAAH2a et AtFAAH avaient des valeurs de couverture de 77 % (43 peptides uniques), 37 % (17 peptides uniques) et 100 % (243 peptides uniques), respectivement. Pris ensemble, ces résultats démontrent la production et la purification des protéines MtFAAH1 et MtFAAH2a, et suggèrent que les deux complexes protéiques MtFAAH purifiés sont plus grands que les dimères AtFAAH1, probablement organisés en homotétramères. Les gels non recadrés / non édités utilisés pour les Figs supplémentaires. S14 à S16 se trouvent dans les Figs supplémentaires. S24–S26.

Dans une première étape de caractérisation, les activités enzymatiques de MtFAAH1 ou MtFAAH2a envers NAE12: 0 ont été mesurées à différentes conditions de pH ou de température (Fig. S17 supplémentaire). Les protéines purifiées par SEC ont été incubées avec 100 µM de NAE12: 0 dans des tampons de réaction avec différentes conditions de pH (6, 0, 7, 0, 8, 0 et 9, 0) ou de température (20, 30, 40 et 50 ° C). Un test flexible à base de fluorescamine a été utilisé pour la détection des produits de réaction, comme indiqué ailleurs22,36. L'activité enzymatique a été calculée en μmol d'éthanolamine produite par minute par milligramme de protéine sur la base d'une courbe standard pour l'éthanolamine. L'activité de MtFAAH1 était la plus élevée à pH 8, 0 ou 9, 0 (Fig. S17 supplémentaire), tandis que MtFAAH2a fonctionnait au maximum à pH 7, 0 ou 8, 0 (Fig. S17 supplémentaire). Notamment, l'activité de MtFAAH2a a considérablement diminué à pH 9,0. Les dépendances tempérées étaient similaires pour MtFAAH1 et MtFAAH2a, avec des activités enzymatiques optimales à des températures comprises entre 30 et 40 ° C (Fig. S17 supplémentaire). La GC – MS a en outre confirmé la conversion de NAE12: 0 en son produit correspondant d'acide gras libre (FFA) (Fig. S18 supplémentaire) pour les enzymes MtFAAH et le contrôle positif, AtFAAH; des enzymes bouillies ("dénaturées") ont été utilisées comme témoins négatifs et n'ont montré aucune conversion du substrat en produit. L'identité du pic NAE12: 0 a été confirmée par le temps de rétention et les ions diagnostiques (Fig. S18 supplémentaire) comme indiqué ailleurs23. L'identité de FFA 12: 0 (acide dodécanoïque) a été confirmée par des ions de diagnostic (Fig. S18 supplémentaire) et via la comparaison de la bibliothèque NIST (≈ 98% de correspondance). Dans les réactions avec MtFAAH1, MtFAAH2a ou AtFAAH bouillis, seuls les pics correspondant au substrat NAE12: 0 sont apparus dans les chromatogrammes (Fig. S18 supplémentaire).

Pour évaluer les progrès de la purification de MtFAAH1 ou MtFAAH2a, les activités enzymatiques ont été mesurées dans les lysats cellulaires, les fractions purifiées par IMAC et SEC vers NAE12: 0 (100 µM) (tableau supplémentaire S7). Les niveaux de purification et les rendements ont été calculés par rapport aux lysats bruts. On a estimé que MtFAAH1 et MtFAAH2a étaient enrichis sur les extraits cellulaires de 1162 fois et 3263 fois, respectivement. L'électrophorèse sur gel SDS a confirmé la pureté de chaque protéine dans les fractions SEC (Fig. 6; Fig. Supplémentaire S13).

Compte tenu des principales différences de résidus entre les SBP de MtFAAH1 et MtFAAH2a, et du fait que les expériences d'amarrage suggèrent une adaptation différentielle des substrats N-acyl, nous avons émis l'hypothèse que de telles différences pourraient entraîner des préférences de substrat distinctes pour MtFAAH1 et MtFAAH2a. Des concentrations croissantes de NAE12: 0, NAE18: 2, NAE-9-HOD, OdDHL, OtDHL, p-coumaryl-HL, p-coumaryltyramine et affinine ont été incubées avec MtFAAH1 ou MtFAAH2a purifié à 30 ° C pendant 30 min (Fig. 7). Des dosages à base de fluorescamine ont été utilisés pour la détection des produits de réaction. La vitesse initiale (V) des réactions est présentée en μmol d'amine produite par minute par milligramme de protéine. Les rapports Kcat / Km dérivés des tracés de Michaelis et Menten ont été utilisés pour comparer les efficacités catalytiques des enzymes pour leurs substrats (Fig. 7). MtFAAH1 présentait les rapports Kcat/Km les plus élevés pour les NAE à longue chaîne (NAE-9-HOD ou NAE18:2) ou les AHL (OdDHL ou OtDHL). Ensuite, par rapport à OtDHL, les rapports Kcat/Km ont diminué de ≈ 2 à 3 fois pour NAE12:0 ou l'affinine. Les valeurs Kcat / Km pour la p-coumaryl-HL ou la p-coumaryltyramine étaient les plus faibles parmi tous les substrats testés pour MtFAAH1 (≈ 7 à 12 fois inférieures à celles de NAE-9-HOD) (Fig. 7a, c). En revanche, MtFAAH2a avait les valeurs Kcat/Km les plus élevées pour l'affinine, la p-coumaryltyramine ou la p-coumaryl-HL. Par rapport au p-coumaryl-HL, le Kcat/Km de MtFAAH2a a diminué de ≈ deux pour NAE12:0, OdDHL ou OtDHL. Notamment, MtFAAH2a présentait les rapports Kcat / Km les plus bas pour NAE18: 2 ou NAE-9-HOD (≈ 4 à neuf fois inférieur à celui de l'affinine) (Fig. 7b, d). Ces données indiquent que dans ces conditions in vitro, MtFAAH1 préfère les substrats lipophiles avec des fragments acyle plus longs, tandis que MtFAAH2a fonctionne mieux avec des substrats avec des fragments acyle courts ou aromatiques (résumés à la Fig. 8).

Courbes cinétiques enzymatiques pour (a) MtFAAH1 et (b) MtFAAH2a. Les MtFAAH ont été incubés avec des concentrations croissantes de NAE12:0, NAE18:2, NAE-9-HOD, OtDHL, OdDHL, p-coumaryl HL, p-coumaryltyramine ou affinine. Les réactions ont été menées dans un tampon de réaction (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM) à pH = 9 et 0, 03% DDM pour MtFAAH1 et à pH = 7, 5 et 0, 06% DDM pour MtFAAH2a. Dans l'axe X, différentes concentrations de substrat (S) (5 à 100 µM) sont affichées. Sur l'axe Y, la vitesse de réaction (V) est indiquée en μmol d'amide produit par unité de temps (min) par quantité de protéine utilisée (mg). Km (constante de Michaelis et Menten) et V ont été calculés dans GraphPad Prism 8.0. Le rapport Kcat (nombre de rotation) / Km désigne l'efficacité amidohydrolase apparente de ( c ) MtFAAH1 ou ( d ) MtFAAH2a vis-à-vis d'un substrat donné. Les données représentent les moyennes ± ET des dosages en triple.

Modèle simplifié montrant les efficacités apparentes d'amidohydrolase de MtFAAH1 ou MtFAAH2a vis-à-vis d'amides N-acylés sélectionnés. Le modèle propose que les différences structurelles et physicochimiques entre les poches de liaison au substrat (SBP) de ces deux MtFAAH, en particulier au niveau du canal d'accès cytosolique (CAC) et du canal de liaison acyle (ABC), soient associées à la sélectivité FAAH pour un substrat donné. En effet, les données informatiques et biochimiques suggèrent un scénario dans lequel MtFAAH1 préfère hydrolyser les longs N-acyl amides alors que MtFAAH2a est meilleur pour hydrolyser les substrats avec une chaîne acyle courte ou une queue aromatique.

La FAAH hydrolyse les structures NAE ou de type NAE en leurs produits correspondants amine (groupe de tête) et acides gras libres (groupe de queue)1,30,37. Récemment, des comparaisons structurelles et phylogénétiques des FAAH de plusieurs angiospermes ont conduit à la découverte de deux groupes de FAAH, FAAH1 et FAAH2, suggérant un profil de substrat FAAH-acylamide plus complexe que ce que l'on pensait auparavant32. Ici, deux isoformes FAAH de la légumineuse Medicago truncatula ont été comparées pour la première fois aux niveaux structurel (prédit) et fonctionnel, révélant des résultats surprenants. Bien que les deux isoformes hydrolysent une gamme de substrats d'acylamide, elles le font avec des efficacités opposées suggérant qu'une conséquence évolutive de l'élaboration de FAAH dans les angiospermes est d'élargir la gamme de substrats d'acylamide pouvant être utilisés par ces enzymes. Ces différences ne sont révélées que maintenant en examinant les isoformes FAAH distribuées en dehors des Brassicaceae32, où un seul FAAH (FAAH1) est présent et où la plupart des études moléculaires et biochimiques ont été menées.

Dans les comparaisons cinétiques de ces FAAH in vitro, MtFAAH1 semblait mieux utiliser les NAE à longue chaîne (par exemple NAE18: 2) que les substrats à chaîne courte ou aromatiques. En revanche, MtFAAH2a était beaucoup moins efficace pour l'hydrolyse des NAE à longue chaîne et hydrolysait à la place des substrats à chaîne courte ou aromatiques (par exemple p-coumaryl-HL) avec une efficacité 10 fois supérieure. Des expériences d'amarrage et de simulation dynamique moléculaire (MDS) avec des substrats dans les SBP de ces deux FAAH ont soutenu ces différences de comportement enzymatique. Il a été prédit que MtFAAH1 aurait un SBP plus ouvert et moins restrictif et un canal d'accès à la membrane (MAC) plus flexible qui s'adapterait mieux aux NAE à longue chaîne (par exemple NAE18: 2). En revanche, le SBP de MtFAAH2a avec NAE18: 2 lié a été façonné différemment et a conduit à une orientation plus compressée de la chaîne acyle plus longue et à un MAC fermé inchangé. De même, l'AtFAAH recombinant (un FAAH1) a hydrolysé une gamme de NAE et d'AHL d'une manière qui dépendait de la longueur de la chaîne acyle plutôt que du groupe de tête polaire22. En effet, il a été démontré ailleurs que l'activité AtFAAH était la plus élevée pour les AHL à longue chaîne (par exemple OdDHL ou OtDHL), et la plus faible pour les AHL plus courtes (par exemple OHHL ou OOHL)22. De même, nous avons observé que MtFAAH1 était significativement meilleur pour hydrolyser OdDHL ou OtDHL que les substrats acyles à chaîne courte ou aromatiques (par exemple p-coumaryl-HL). D'autre part, les acylamides à chaîne courte ou aromatiques ont été bien logés dans le SBP de MtFAAH2a; dans les expériences d'amarrage et de MDS avec un aryl-HL, la tête du cycle lactone et la queue aromatique du p-coumaryl-HL semblaient être mieux adaptées dans le SBP de MtFAAH2a que dans MtFAAH1, peut-être attribué en partie à la présence de grandes aromatiques résidus dans MtFAAH2a (par exemple Tyr533, Tyr444, Trp341). Les alcamides (par exemple l'affinine) sont de mauvais substrats pour AtFAAH20. Ici, les données cinétiques pour MtFAAH1 soutiennent une conclusion similaire où MtFAAH1 hydrolysait plus efficacement les NAE à longue chaîne que l'affinine. En revanche, MtFAAH2a a présenté les efficacités catalytiques les plus élevées vis-à-vis de l'affinine par rapport aux NAE, et il est probable que le plus grand nombre de résidus non polaires dans le canal d'accès cytosolique de MtFAAH2a a contribué à soutenir l'interaction avec les alcamides. Dans l'ensemble, il semble que les différences structurelles entre les SBP de MtFAAH1 et MtFAAH2a et leurs interactions prévues avec les substrats étaient globalement cohérentes avec les différences observées dans les efficacités hydrolytiques (Fig. 6). Notamment, la molécule de détection de quorum p-coumaryl-HL38 était un substrat efficace pour MtFAAH2a. Il est tentant de supposer que M. truncatula a développé une machinerie FAAH2 qui élargit la gamme de "communication" chimique des plantes pour les interactions microbiennes. Bien que les implications biologiques de l'hydrolyse du p-coumaryl-HL par MtFAAH2a dépassent le cadre de cette étude, nos résultats fournissent des idées intéressantes pour tester la ou les fonctions potentielles de MtFAAH2a in planta.

La divergence observée dans les préférences de substrat entre les deux isoformes de Medicago FAAH rappelle quelque peu le concept chez les mammifères placentaires où deux isoformes divergentes de FAAH sont présentes. Chez l'homme, les taux d'hydrolyse de deux FAAH différents (≈ 20 % d'identité) ont montré des préférences distinctes et qui se chevauchent envers différents substrats39. Dans cette étude, un FAAH1 était beaucoup plus efficace pour hydrolyser les substrats polyinsaturés (par exemple NAE20: 4) alors que FAAH2 préférait les amides d'acyle monoinsaturés (par exemple l'oléamide). Dans le même rapport; FAAH1 était capable de traiter l'acide aminé conjugué amide d'acyle, N-oléoyl-taurine (NAT), tandis que FAAH2 était incapable d'utiliser ce substrat. Fait intéressant, les deux FAAH ont également hydrolysé NAE18:139. Au moins pour le FAAH1 de mammifère, il est rapporté que la liaison au substrat dans le site actif est influencée par deux résidus d'acides aminés aromatiques qui forment une "palette dynamique" et cela peut contribuer à la sélectivité du substrat1,6. Un troisième type d'amide hydrolase chez les mammifères a une préférence de substrat très stricte. Chez le lapin (Oryctolagus cuniculus), une cystéine hydrolase, appelée N-acyléthanolamine amidase acide (NAAA) s'est avérée avoir une préférence marquée pour NAE16: 0, et cela semble dépendre de la nature de sa SBP. En effet, il semble qu'à travers l'évolution, NAAA ait acquis une SBP de forme restrictive optimale pour NAE16:0, et moins efficace vis-à-vis d'autres amides d'acyle à chaîne acyle plus longue ou plus courte40. Ainsi, comme les mammifères, la légumineuse M. truncatula peut avoir élaboré des isoformes FAAH qui traitent sélectivement une gamme de substrats d'acylamide.

Les propriétés biochimiques de ce qui est maintenant considéré comme les FAAH du groupe 1 ont été caractérisées précédemment à partir d'Arabidopsis1,41, du riz42, de Medicago truncatula42 et d'une mousse (P. patens)9, bien que toutes les études n'aient pas été réalisées avec des enzymes purifiées, et pas toutes les FAAH1 les homologues ont été testés avec une large gamme de substrats d'acylamide. Ici, les propriétés biochimiques d'une enzyme FAAH du groupe 2 sont décrites pour la première fois, et certaines similitudes et différences avec les isoformes FAAH du groupe 1 ont été notées dans la progression de la purification et dans les dosages de l'activité enzymatique. En plus des différences dans les préférences apparentes de substrat telles que décrites ci-dessus, d'autres caractéristiques des enzymes étaient différentes. Le point isoélectrique de MtFAAH2a est significativement plus élevé que celui de MtFAAH1 (ou d'autres protéines FAAH1) qui nécessitait des conditions modifiées de solubilité au cours de la purification (et a également probablement influencé le pH optimal pour les essais in vitro). La prise en compte du pH du tampon par rapport au point isoélectrique de la protéine est importante pour la purification des protéines recombinantes, comme indiqué ailleurs43. De plus, MtFAAH2 nécessitait deux fois la concentration de DDM par rapport à MtFAAH1 pour maintenir la solubilisation pendant la progression de la purification. Malgré ces différences, MtFAAH1 et MtFAAH2a ont été purifiés jusqu'à une quasi-homogénéité et, sur la base de leur migration par rapport aux normes connues, semblaient tous deux se résoudre sous forme de tétramères homomères dans SEC. Dans l'ensemble, les facteurs identifiés ici faciliteront les études futures des enzymes FAAH dans d'autres espèces végétales.

Nos données ont systématiquement soutenu l'idée que MtFAAH1 et MtFAAH2a peuvent être trouvés sous forme d'oligomères tétramères lorsqu'ils sont purifiés en solution avec un détergent, alors que AtFAAH a été solubilisé sous forme de dimère. Les rapports précédents soutiennent les états oligomères des FAAH de plusieurs organismes. Par exemple, la structure cristalline du FAAH d'Arabidopsis ou du champignon Candida albicans indiquait des dimères1,44. Notamment, Rat FAAH est également signalé comme un dimère lorsqu'il est purifié en solution, mais peut former trois octamères de dimères en l'absence de détergent45. Les différences de taille évidentes des apoenzymes purifiées ici à partir de Medicago truncatula (différentes de la seule autre plante FAAH, AtFAAH, pour laquelle il existe une structure) sont intrigantes et peuvent avoir des implications fonctionnelles importantes, mais la structure quaternaire et sa pertinence fonctionnelle doivent attendre l'avenir. études. De plus, il reste à voir si cette organisation tétramérique prédite est une caractéristique des isoformes FAAH d'autres espèces végétales en dehors des Brassicaceae.

En conclusion, les MtFAAH hydrolysent de manière différentielle une large gamme de NAE, d'acyl-HL, d'aryl-HL, d'alcamides ou d'amides phénoliques. Ces résultats coïncident avec des différences entre l'organisation structurelle prédite des SBP de MtFAAH1 et MtFAAH2a. Bien que dans nos enquêtes, nous ayons examiné les capacités in vitro des MtFAAH par rapport à des substrats qui s'accumulent de manière endogène dans les tissus végétaux (par exemple, les NAE) ou dans les bactéries (par exemple, les AHL), il est possible que d'autres substrats lipophiles ayant une pertinence physiologique restent à découvrir. . D'autres études aux niveaux génétique et physiologique aideront à démêler la fonction d'autres isoformes FAAH dans Medicago truncatula. De plus, un examen supplémentaire des isoformes FAAH dans d'autres espèces végétales sera nécessaire pour déterminer l'importance plus large de l'hydrolyse de l'acylamide médiée par FAAH dans les plantes. Néanmoins, cette étude fournit une base pour les travaux futurs visant à découvrir la signification physiologique potentielle et les applications biotechnologiques possibles.

Les séquences de légumineuses utilisées pour la figure 1a ont été extraites de la base de données NCBI (tableau supplémentaire S1). L'analyse phylogénétique a été réalisée avec l'outil en ligne « Phylogeny.fr » avec les paramètres par défaut46. L'alignement des séquences a été effectué dans Clustal Omega47 (Figs. Supplémentaires S1, S7). Les modèles d'homologie MtFAAH1 et MtFAAH2a ont été construits avec Arabidopsis FAAH comme matrice (AtFAAH; 6DHV) dans SWISS-MODEL48. Les modèles 3D ont été visualisés dans Pymol49 et BIOVIA Discovery Studio Visualizer50. Les résidus qui comprennent le capuchon de liaison à la membrane (MBC), le canal d'accès à la membrane (MAC), la région de l'hélice (qui devrait être impliquée dans l'hébergement de la queue de l'acylamide) et les structures de la poche de liaison au substrat (SBP) pour les MtFAAH ont été prédits à partir des détails de la structure AtFAAH1 ( Figures 4, 5 ; Tableau supplémentaire S5, S6). Antheprot3D a été utilisé pour prédire le contenu de la structure secondaire51 (Fig. S5 supplémentaire). Les paramètres de qualité pour les modèles MtFAAH générés dans SWISS-MODEL incluent ; Scores GMQE (estimation globale de la qualité du modèle), QMEANDisCo (contrainte de distance basée sur le consensus Qmean) et tracés et scores de Ramachandran (Figs supplémentaires. S3, S4; Tableau supplémentaire S3, S4).

Les profils d'expression de MtFAAH1, MtFAAH2a et MtFAAH2b ont été extraits du Medicago truncatula Gene Expression Atlas "MtExpress"34. Les séquences MtFAAH correspondantes (voir le tableau supplémentaire S1 pour les numéros d'accession) ont été utilisées comme entrée dans l'outil BLAST construit dans l'Atlas.

Les topologies des formes apo de MtFAAH1 et MtFAAH2a ont été réalisées avec le champ de force Amber (ff19SB)52. Une boîte cubique de 12 Å a été construite autour des isoformes apo MtFAAH, et les systèmes ont été solvatés dans l'eau TIP3P53. La neutralisation des charges a été réalisée par des ions Na+ et Cl- à une concentration de 0,15 M. Le système a été soumis à une minimisation énergétique avec une température de 298 K, et une pression d'un bar. Ensuite, les systèmes ont été équilibrés avec une constante de force de 500 kJ/mol pendant 5 ns. Des simulations dynamiques moléculaires (MDS) ont été réalisées dans l'environnement de simulations moléculaires basé sur le cloud développé ailleurs54. Ce pipeline utilise la boîte à outils Open MM55 pour générer des ensembles à température constante et pression constante (NPT). L'environnement MD avait une température de 298 K et une pression d'un bar. Le GPU et les unités informatiques de Google Collab ont été utilisés pour exécuter des simulations de 100 ns pour les deux MtFAAH. Chaque simulation a pris 12 à 13 h pour se terminer. Les trajectoires RMSD et RMSF ont été générées avec les boîtes à outils MDAnalysis56 ou PyTraj57, puis traitées ultérieurement dans Excel 2021 (Fig. S8 supplémentaire).

Toutes les structures 2D ont été dessinées à l'aide du logiciel ChemDraw (Molecular Editor). Les substrats et les enzymes ont été préparés comme suit ; les fichiers SDF de NAE18:2 (CID : 5 283 446), NAE12:0 (CID : 8899) ou p-coumaryl-HL (CID : 71 311 837) ont été extraits de PubChem. Ensuite, Babel 3.0.158 a été utilisé pour convertir les fichiers SDF au format PDB. Les fichiers PDB des structures apo MtFAAH générées après MDS de 100 ns (voir ci-dessus) ont été utilisés pour des expériences d'amarrage avant élimination de l'eau, des ions Na+ et Cl-. Des hydrogènes ont été ajoutés aux substrats et aux modèles de protéines MtFAAH1 ou MtFAAH2a dans Pymol49. La minimisation de l'énergie a été réalisée dans PyRx59 avec les paramètres par défaut.

L'amarrage dans le logiciel GOLD 3.0.160 était centré sur la liaison covalente entre les oxygènes de la chaîne latérale (Oγ) des résidus catalytiques de MtFAAH1 (Ser304; numéro atomique 4628) ou MtFAAH2a (Ser311; numéro atomique 4678) et le carbone du carbonyle de NAE18:2, NAE12:0 ou p-coumaryl-HL. La détection de la cavité a été réglée avec un rayon de 20 Å autour du site actif. Des constantes de ressort entre 50 et 500 et des séparations minimales (1,30 Å) et maximales (1,60 Å) ont été utilisées dans les paramètres de contrainte. Les paramètres de recuit pour van der Waals et la liaison hydrogène ont été fixés à 6 et 3 Å, respectivement. L'algorithme a été défini avec des valeurs d'énergie externe et interne de 1,4 et 1,0, respectivement. Les poses prédites ont été classées sur la base du score GOLD de fitness. La pose avec le score le plus élevé a été choisie pour une analyse plus approfondie. Toutes les poses choisies dans cette étude avaient des scores GOLD supérieurs à 10. Les prédictions d'amarrage ont été visualisées dans Pymol49 et BIOVIA Discovery Studio Visualizer50. Les interactions putatives telles que les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes ont été prédites dans le serveur PLIP (Protein-Ligand Interaction profiler)61.

Les topologies des protéines (MtFAAH1 ou MtFAAH2a) et des ligands (NAE18:2 ou p-coumaryl-HL) ont été générées avec les champs de force Amber ff19SB55 et GAFF262, respectivement. Une boîte cubique de 15 Å a été construite autour des complexes protéine-ligand, puis les systèmes ont été solvatés dans l'eau TIP3P53. La neutralisation des charges a été réalisée par des ions Na+ et Cl- à une concentration de 0,15 M. Le système a été soumis à une minimisation énergétique avec une température de 298 K, et une pression d'un bar. Les systèmes ont été équilibrés avec une constante de force de 1600 kJ/mol pendant 5 ns. Des expériences MDS ont été réalisées dans le pipeline de simulations moléculaires basées sur le cloud développé ailleurs54. La même température et la même pression utilisées pour l'équilibrage ont été utilisées pour la production de MD. Le GPU et les unités informatiques de Google Collab ont été utilisés pour exécuter des simulations de 100 ns pour tous les complexes MtFAAH-ligand. Chaque simulation a pris 12 à 13 h pour se terminer. Les trajectoires et les fichiers journaux ont été enregistrés toutes les 100 ps. De plus, pour imiter l'interaction de liaison covalente entre les oxygènes de la chaîne latérale (Oγ) des résidus catalytiques des MtFAAH et le carbone du groupe carbonyle des ligands, nous avons ajouté une contrainte harmonique entre ces atomes sous l'outil MonteCarloBarostat dans le pipeline " Fais qu'il pleuve"54. Les trajectoires RMSD et RMSF ont été générées avec les kits d'outils MDAnalysis56 ou PyTraj57, puis traitées dans Excel 2021 (Fig. S10 supplémentaire). L'analyse de corrélation croisée de Pearson a été générée dans le même pipeline54 (Fig. S11 supplémentaire). Les complexes équilibrés (temps = 0 ns) et les complexes traités par MD à 10 ns et 100 ns ont été traités dans Pymol49 en éliminant l'eau et les ions Na + et Cl- de leurs structures (Fig. 4 et 5). Les fichiers PDB et les trajectoires dcd des complexes MtFAAH-ligand ont été chargés dans le logiciel VMD63 pour l'analyse de la simulation MD. VideoMach64 a été couplé à VMD pour générer les vidéos correspondant aux expériences MDS (Supplementary Videos S1–S12).

Qiagen RNeasy Plant Mini Kit a été utilisé pour l'extraction d'ARN à partir de tiges de semis de Medicago truncatula Gaertner (génotype sauvage Jemalong A17) âgés de 21 jours. Les graines de M. truncatula (A17) étaient un don du Dr Rebecca Dickstein de l'Université du Nord du Texas (UNT), comme indiqué et utilisé ailleurs65. Les semis utilisés pour l'extraction d'ARN ont été cultivés dans des chambres éclairées et leur utilisation était conforme aux directives internationales, nationales et/ou institutionnelles. La synthèse d'ADNc a été réalisée avec le kit Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Thermo Fisher, en suivant les instructions du fabricant. Deux cycles de PCR (PCR nichée) ont été nécessaires pour obtenir la séquence codante pleine longueur (CDS) de MtFAAH1 (Fig. S12 supplémentaire). Le codon stop de MtFAAH1 a été retiré de son CDS avec des amorces spécifiques (tableau supplémentaire S8). L'ADN polymérase haute fidélité Phusion (New England BioLabs) a été utilisée pour la PCR haute fidélité. L'échelle d'ADN MassRuler de 1 Kb (Thermo Fisher) a été utilisée pour estimer la taille du produit de PCR. L'insertion de MtFAAH1 CDS dans le plasmide pTrcHIS2 (Invitrogen) a été réalisée par clonage TA, en suivant les instructions du fabricant.

Le CDS de MtFAAH2a a été synthétisé par GENEWIZ et inséré dans le vecteur pUC57-Amp. Ensuite, des amorces spécifiques (tableau supplémentaire S8) ont été utilisées pour l'élimination du codon d'arrêt et le sous-clonage dans le plasmide pTrcHIS2 (Invitrogen) (Fig. S12 supplémentaire), comme décrit ci-dessus. Tous les vecteurs ont été confirmés comme étant corrects par séquençage d'ADN avant l'expression hétérologue.

Le MtFAAH1 recombinant a été produit dans des cellules E. coli BL21 (DE3) à partir du plasmide pTrcHIS2 (Invitrogen) avec des étiquettes c-myc et histidine (6X) C-terminales. Des cultures d'une nuit ont été cultivées avec 100 µg/mL d'ampicilline (GoldBio) à 37 °C et ont été inoculées dans du LB frais contenant 100 µg/mL d'ampicilline et cultivées à 37 °C jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,5–1,0. La production de protéines a été induite avec 1 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (GoldBio) pendant 18 h à 16 ° C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4000 Xg pendant 30 min à 4°C puis congelées à - 80°C pendant la nuit. Après décongélation dans un tampon de lyse (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, Triton X-100 1 % (v/v), EDTA 1 mM, E-64 1 µM, pepstatine 1 µM, lysozyme 1 mg/mL (Sigma ) et 25 unités/mL de benzonase nucléase (Sigma) ont tous été ajoutés. Le culot cellulaire a été suspendu par rotation à 30 tr/min pendant 30 min à 4 ° C puis soniqué (processeur à ultrasons GEX 130) pendant 8 min à une intensité de 20 % avec 30 s d'impulsions et 30 s d'impulsions. Les débris cellulaires ont été culottés à 14 000 Xg pendant 30 min à 4 ° C et le lysat a été incubé avec de la résine d'agarose Ni – NTA (Qiagen) et mis en suspension par rotation à 30 tr/min pendant 1 h à 4 ° C. Une fois le lysat cellulaire complètement séparé de la résine à l'aide d'une colonne à écoulement par gravité, la résine a été lavée avec deux tampons : (1) Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, Triton X-100 1 %, Imidazole 10 mM ; (2) 50 mM Tris–HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 0,03 % (p/v) dodécyl bêta-D-maltoside (DDM), 25 mM Imidazole. La protéine recombinante marquée His a ensuite été éluée de la résine avec 50 mM Tris – HCl pH 8, 0, 500 mM NaCl, 0, 03% DDM, 250 mM imidazole, 1 mM EDTA, 1 µM E-64, 1 µM pepstatine. Du DTT (1 mM) a été ajouté frais à la fraction éluée et stocké à 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain, la fraction éluée a été concentrée et remplacée par du Bis-Tris-Propane 50 mM pH 9, 0, NaCl 100 mM, 0, 03% DDM à l'aide d'un filtre centrifuge de 30 000 MWCO (Sartorius). La protéine recombinante a été davantage purifiée et fractionnée à l'aide d'une colonne Superdex 200 augmentation 10/300 GL (Cytiva) sur un système AKTA Pure (Cytiva). Les fractions éluées par SEC ont été observées à une absorbance UV de 280 nm, fractionnées et collectées pour une analyse SDS-PAGE, LC/MS/MS ou des tests d'activité enzymatique.

Le MtFAAH2a recombinant a été purifié avec les mêmes méthodes que MtFAAH1 (voir ci-dessus) à l'exception du pH du tampon et de la concentration du détergent. Pour MtFAAH2a, tous les tampons étaient à pH 7,5 et 0,06 % de DDM pendant le processus de purification. Les fractions SEC ont été recueillies pour l'analyse SDS-PAGE, LC/MS/MS et les tests d'activité enzymatique.

Les bandes de gel ont été déshydratées avec de l'acétonitrile à 100 % et incubées avec du dithiothréitol 10 mM dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM, pH ≈ 8, à 56 °C pendant 45 min, déshydratées à nouveau et incubées dans l'obscurité avec de l'iodoacétamide 50 mM dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM pendant 20 minutes. min. Les bandes de gel ont ensuite été lavées avec du bicarbonate d'ammonium 100 mM et déshydratées à nouveau. La trypsine, la chymotrypsine et l'Asp-N modifiées de qualité séquençage ont été préparées à 0,01 µg/µL dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM et ≈ 50 µL de celui-ci ont été ajoutés à chaque bande de gel afin que le gel soit complètement submergé. Les bandes ont ensuite été incubées à 37°C pendant une nuit. Les peptides ont été extraits du gel par sonication au bain-marie dans une solution de 60 % d'acétonitrile/1 % de TCA et séchés sous vide à ≈ 2 µL.

Les peptides ont ensuite été remis en suspension dans 2 % d'acétonitrile/0,1 % de TFA à 20 µL. À partir de là, 5 µL ont été automatiquement injectés par EASYnLC 1000 sur un piège à peptides Thermo Acclaim PepMap 0,1 mm × 20 mm C18 et lavés pendant ≈ 5 min. Les peptides liés ont ensuite été élués sur une colonne Thermo Acclaim PepMap RSLC 0,075 mm × 250 mm C18 pendant 35 min avec un gradient de 5 % B à 38 % B en 24 min, passant à 90 % B à 25 min et maintenu à 90 % B pendant toute la durée de l'analyse à un débit constant de 0,3 µL/min (Tampon A = 99,9 % eau/0,1 % acide formique, Tampon B = 99,9 % acétonitrile/0,1 % acide formique). La colonne a été maintenue à 50 ° C à l'aide d'un réchauffeur de colonne intégré (PRSO-V1, Sonation GmbH, Biberach, Allemagne).

Les peptides élués ont été pulvérisés dans un spectromètre de masse ThermoFisher Q-Exactive à l'aide d'une source d'ions de pulvérisation Flex Spray. Des scans d'enquête ont été effectués dans l'Orbitrap (résolution de 70 000, déterminée à m/z 200) et les 15 premiers ions de chaque scan d'enquête ont ensuite été soumis à une dissociation induite par collision (HCD) automatique à plus haute énergie avec des spectres de fragments acquis à une résolution de 17 500. Les spectres MS/MS résultants ont été convertis en listes de pics à l'aide de Mascot Distiller, v2.8.0.1 (www.matrixscience.com) et recherchés dans une base de données qui comprenait des séquences de protéines FAAH et des séquences de protéines E. coli disponibles auprès d'Uniprot (www. uniprot.org) accompagnés des contaminants de laboratoire courants (téléchargés depuis www.thegpm.org, projet cRAP) à l'aide de l'algorithme de recherche Mascot, v 2.7.1. La sortie Mascot a ensuite été analysée à l'aide de Scaffold, v5.0.1 (www.proteomesoftware.com) pour valider de manière probabiliste les identifications de protéines. Les affectations validées à l'aide du filtre de confiance Scaffold 1 % FDR sont considérées comme vraies. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange66 via le référentiel partenaire PRIDE67,68 avec l'identifiant de jeu de données PXD038494 et https://doi.org/10.6019/PXD038494.

Les courbes standard ont été composées en traçant le coefficient de distribution (Kav) en fonction du logarithme des poids moléculaires des normes connues (thyroglobuline, γ-globuline, ovalbumine, myoglobine et vitamine B12, Bio-Rad ; apoferritine, Sigma) selon le Cytiva SEC Handbook , Annexe 6. Deux normes distinctes et des courbes standard ont été préparées en fonction des différentes conditions utilisées pour purifier les MtFAAH. Ensuite, le Kav de chaque FAAH a été calculé en utilisant le volume d'élution moyen du pic de six purifications effectuées à des jours différents. Après avoir interpolé cette valeur sur la courbe respective, nous avons calculé le poids moléculaire et estimé les états d'oligomérisation après avoir pris en compte le nombre d'agrégation du détergent35. Les calculs ont été effectués dans GraphPad Prism 8.0.

Les échantillons prélevés au cours de la purification ont été quantifiés par dosage BCA Rapid Gold (Thermo) et séparés dans un gel de résolution à 10% préparé par SDS-PAGE (Bio-Rad). Dix microgrammes du lysat cellulaire, des débris cellulaires granulés et du flux ainsi que 2 ug de la protéine purifiée par affinité au nickel et 2 ug de la protéine purifiée SEC ont été soumis à SDS-PAGE. Les échantillons ont été dénaturés dans du tampon Laemmili 4 × (Bio-Rad) avec 10 % (v/v) de β-mercaptoéthanol et l'électrophorèse a été réalisée à 175 volts constants pendant 50 min. Les gels ont ensuite été colorés avec du colorant au bleu de Coomassie colloïdal QC (Bio-Rad) conformément au protocole du fabricant (Fig. 6b, d; Fig. supplémentaires S14 à S16, S19, S20, S24 à 26). Alternativement, des gels sans taches BIO-RAD ont été utilisés dans les expériences (Figs. Supplémentaires S13, S21-S23). Les poids moléculaires (MW) et les points isoélectriques (pI) des séquences d'acides aminés ont été calculés avec l'outil ExPasy en ligne (https://web.expasy.org/protparam). Sans les codons stop, MtFAAH1 avait un MW de 66,02 kDa et un pi de 5,83 alors que MtFAAH2a avait un MW de 66,71 kDa et un pI de 8,48. Les bandes de gel ont été analysées et comparées à des standards connus (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad) en référence aux poids moléculaires calculés des FAAH. Les gels SDS-PAGE non recadrés / non édités utilisés pour les Fig. 6b, d peuvent être trouvés dans les Figs supplémentaires. S19 et S20, respectivement. Les gels SDS-PAGE non recadrés / non édités utilisés pour la Fig. S13 supplémentaire peuvent être trouvés dans les Figs supplémentaires. S21–S23 alors que les gels originaux utilisés pour les Figs supplémentaires. S14 à S16 se trouvent dans les Figs supplémentaires. S24–S26.

Des tests d'activité enzymatique basés sur le GCMS ont été effectués comme décrit ailleurs12 pour confirmer les substrats et les produits de réaction, avec quelques modifications. Brièvement, le tampon de réaction 1 (50 mM Bis–Tris Propane ; pH = 9,0 ; 0,03 % DDM) ou le tampon de réaction 2 (50 mM Tris–HCl, 500 mM NaCl ; pH = 7,5 ; 0,06 % DDM) ont été mélangés avec 100 µM ( concentration finale diluée à partir d'une solution mère 10 mM dans du DMSO) de NAE12:0. Ensuite, 5 μg de MtFAAH1 ou MtFAAH2a recombinant ont été ajoutés aux mélanges réactionnels 1 ou 2, respectivement. Les réactions avec 1 μg d'AtFAAH dans le mélange réactionnel 1 ont été incluses comme contrôle positif. Le mélange réactionnel a été incubé à 30 °C sous agitation (120 tr/min) pendant 1 h. Des réactions parallèles avec l'enzyme bouillie (15 à 30 min à 80 à 100 ° C) ont été incluses comme témoins négatifs. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant de l'isopropanol préchauffé (IPA), suivi d'une incubation à 70 ° C pendant 30 min. Ensuite, une méthode d'extraction à base de chloroforme a été réalisée pour isoler les lipides générés par les réactions. Les produits lipidiques ont été séchés sous N2 et remis en suspension dans 50 µL de BSTFA pour dérivation (30 min à 50 °C). Ensuite, les échantillons ont été séchés sous N2 et remis en suspension dans 70 µL d'hexane. Les échantillons ont été analysés par GCMS (modèle Agilent 7693) dans les conditions suivantes ; sans division pulsée (mode injection) avec une pression interne et un débit de purge de 48 (kPa) et 50 (mL/min), respectivement. L'hélium était la phase porteuse mobile. La phase stationnaire était une colonne capillaire (colonne GC Agilent HP-5 ms) d'une longueur de 30 mm, d'un diamètre interne de 0,25 mm et d'une épaisseur de film de 0,25 μM. Le GCMS a été ajusté pour le module MS à impact électronique (EI) et les données spectrales de masse ont été collectées en mode balayage complet. Les produits de réaction ont été identifiés comme étant des dérivés de tryméthylsilyle (TMS). Enfin, l'identification et la quantification des espèces lipidiques à partir des réactions ont été réalisées par analyse de leurs temps de rétention maximaux, des spectres de masse correspondants, des espèces diagnostiques TMS-ion et/ou de la recherche dans la bibliothèque du NIST (National Institute of Standards and Technology).

Des dosages d'activité enzymatique à base de fluorescamine ont été effectués comme développés et décrits ailleurs22,36, avec quelques modifications. Pour les tests d'activité enzymatique à différentes conditions de pH, MtFAAH1 ou MtFAAH2a recombinants (1 μg) ont été incubés avec 100 μM de NAE12: 0 dans le tampon de réaction 1 (100 mM K-phosphate, 6 mM de K2-phosphate; pH = 6), tampon de réaction 2 (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM ; pH = 7), tampon de réaction 3 (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM ; pH = 8) ou tampon de réaction 4 (Tris-HCl 25 mM, MgCl2 10 mM ; pH = 9) dans une plaque multiniveau à 96 puits pendant 5 à 10 min à 30 °C. Du DDM (0, 03% ou 0, 06%) a été ajouté dans chaque réaction avec MtFAAH1 ou MtFAAH2a, respectivement. Des substrats ont été ajoutés à partir de solutions mères aux concentrations finales souhaitées pour démarrer les réactions. Des réactions parallèles avec l'enzyme bouillie (30 min à 80-100 ° C) ont été incluses comme témoins négatifs. Trois réactions indépendantes (réplique) ont été réalisées dans les expériences. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant 20 µL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (stock 10 mM dans du DMSO). Une aliquote de 15 μL a été mélangée avec 45 μL de fluorescamine (stock de 3,6 mM dans l'acétone) et 97,5 μL d'eau milliq dans une microplaque à 96 puits pour les dosages basés sur la fluorescence. Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 5 min à température ambiante. La fluorescence a été mesurée dans un lecteur de microplaques multimode BioTek Synergy 2 réglé à 390 nm (excitation) et 475 nm (émission). Les valeurs fluorescentes brutes des réactions ont été soustraites des lectures du contrôle négatif. Ensuite, pour transformer les valeurs fluorescentes en µmol d'éthanolamine produite, des courbes standard ont été construites séparément avec des concentrations variables d'éthanolamine (Sigma-Aldrich) mises à réagir avec la fluorescamine. Des tests d'activité enzymatique à cinq conditions de température différentes (20, 30, 40, 50 ou 80 ° C) ont également été effectués comme décrit ci-dessus.

Pour le tableau de purification (tableau supplémentaire S7), le lysat cellulaire, les fractions purifiées IMAC ou SEC ont été utilisées comme sources d'enzymes pour les tests d'activité enzymatique contre NAE12: 0, selon la stratégie indiquée ci-dessus. L'activité totale est représentée par une unité enzymatique (U), et cela représente la μmol de produit (éthanolamine) généré par unité de temps (min). L'activité spécifique a été calculée en divisant l'activité totale par la quantité (mg) de protéine utilisée dans les dosages. Le rendement est représenté sous forme de valeurs en pourcentage, et il représente l'activité enzymatique qui est conservée après chaque étape de purification. Le rendement des fractions IMAC ou SEC a été calculé en divisant l'activité totale de chacune de ces étapes par l'activité totale dérivée du lysat cellulaire brut. Le niveau de purification a été calculé comme un rapport entre l'activité spécifique des fractions IMAC ou SEC et l'activité spécifique calculée pour le lysat cellulaire brut. La moyenne des réactions indépendantes en triple est présentée dans le tableau supplémentaire S7.

Pour les tests de cinétique enzymatique, des MtFAAH1 ou MtFAAH2a recombinants (1 μg) ont été incubés avec des concentrations croissantes de substrats NAE ou de type NAE (5–100 μM) dans un tampon de réaction (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM) à pH = 9 et 0,03 % DDM pour MtFAAH1 et à pH = 7,5 et 0,06 % DDM pour MtFAAH2a. Le mélange réactionnel a été incubé pendant 5 à 10 min à 30 °C. Des réactions parallèles avec l'enzyme bouillie (30 min à 100 ° C) ont été incluses en tant que témoins négatifs. Trois réactions indépendantes (répliques techniques) ont été réalisées dans les expériences. Substrats inclus ; NAE12:0 (synthétisé en interne), NAE18:2 (Cayman Chemical), NAE-9-HOD (synthétisé en interne, comme rapporté ailleurs23), OdDHL (Sigma-Aldrich), OtDHL (Sigma-Aldrich), p-coumaryl- HL (Sigma-Aldrich), p-coumaryltyramine (don du Dr David Mackey) et affinine (don du Dr Jorge Molina Torres). Les réactions ont été arrêtées en ajoutant 20 µL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (10 mM dans du DMSO). Une aliquote de la réaction a été mélangée avec de la fluorescamine et de l'eau comme décrit ci-dessus. Le mélange a été incubé pendant 5 min à température ambiante. La fluorescence a été mesurée comme décrit ci-dessus.

Pour transformer les valeurs fluorescentes en µmol d'amine produite, des courbes standard ont été construites avec des concentrations croissantes d'éthanolamine (Sigma-Aldrich) (pour les NAE), d'homosérine lactone (Sigma-Aldrich) (pour les AHL et p-coumaryl-HL), de tyramine (Sigma -Aldrich) (pour la p-coumaryltyramine) ou les étalons d'isobutylamine (pour l'affinine) (Sigma-Aldrich). Les paramètres cinétiques enzymatiques apparents ont été calculés dans GraphPad Prism 8.0. Les courbes ajustées avaient des valeurs R2 de 0,54 à 0,94 pour MtFAAH1 et de 0,78 à 0,94 pour MtFAAH2a.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse générées et analysées au cours de l'étude en cours sont disponibles via ProteomeXchange avec l'identifiant PXD038494.

La version en ligne originale de cet article a été révisée : l'ordre de la vidéo supplémentaire 2, de la vidéo supplémentaire 3, de la vidéo supplémentaire 4, de la vidéo supplémentaire 5, de la vidéo supplémentaire 6, de la vidéo supplémentaire 7, de la vidéo supplémentaire 8, de la vidéo supplémentaire 9, de la vidéo supplémentaire 10. , la vidéo supplémentaire 11 et la vidéo supplémentaire 12 ont été définies à tort comme vidéo supplémentaire 10, vidéo supplémentaire 11, vidéo supplémentaire 12, vidéo supplémentaire 2, vidéo supplémentaire 3, vidéo supplémentaire 4, vidéo supplémentaire 5, vidéo supplémentaire 6, vidéo supplémentaire 7, vidéo supplémentaire 8 et vidéo supplémentaire 9. La vidéo supplémentaire 1 était correcte à partir du moment de la publication.

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Nous remercions le Dr Xiaoqiang Wang (BioDiscovery Institute, University of North Texas) pour avoir donné accès au logiciel GOLD 3.0.1 qui a été utilisé pour les expériences d'amarrage moléculaire. Nous remercions le Dr David Mackey (Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University) pour avoir fourni la p-coumaryltyramine qui a été utilisée dans les expériences. Nous remercions le Dr Jorge Molina Torres (CINVESTAV-IPN, Irapuato, Mexique) pour avoir fourni l'affinine qui a été utilisée dans les expériences. Nous remercions Douglas Whitten (Research Technology Support Facility, Michigan State University) pour son aide à l'identification des protéines recombinantes en LC/MS/MS. Cette recherche a été soutenue par la US National Science Foundation (IOS 2051636).

BioDiscovery Institute, Département des sciences biologiques, Université du nord du Texas, Denton, TX, États-Unis

Omar Arias-Gaguancela, Emily Herrell, Mina Aziz et Kent D. Chapman

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Recherche conçue par OAG, EH, MA et KDC. MA a établi les conditions initiales pour la purification des protéines et a fourni des conseils concernant les tests d'activité enzymatique. OAG et EH ont réalisé les expériences. OAG, EH et KDC ont analysé les données. OAG et EH ont rédigé la première ébauche du manuscrit. KDC a édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Kent D. Chapman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Arias-Gaguancela, O., Herrell, E., Aziz, M. et al. Deux isoformes d'hydrolase d'amides d'acides gras de légumineuses avec des préférences distinctes pour les acylamides d'origine microbienne et végétale. Sci Rep 13, 7486 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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Reçu : 22 novembre 2022

Accepté : 06 mai 2023

Publié: 09 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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