Flavin

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4896 (2022) Citer cet article

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Les réactions d'ouverture de cycle époxyde sont courantes et importantes à la fois dans les processus biologiques et les applications synthétiques et peuvent être catalysées de manière non redox par des époxydes hydrolases ou de manière réductrice par des oxydoréductases. Nous rapportons ici que les fluostatines (FST), une famille d'angucyclines atypiques avec un noyau de benzofluorène, peuvent subir des réactions d'ouverture de cycle époxyde non catalysées par une enzyme en présence de flavine adénine dinucléotide (FAD) et de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH). Le cycle 2,3-époxyde dans FST C s'ouvre de manière réductrice via un intermédiaire énol putatif, ou de manière oxydative via un intermédiaire peroxylé avec de l'oxygène moléculaire comme oxydant. Ces réactions conduisent à plusieurs produits avec différents états redox qui possèdent un seul groupe hydroxyle en C-2, un diol 2,3-vicinal, un cycle A à cinq chaînons contracté ou un cycle A à sept chaînons élargi. Des réactions similaires ont également lieu dans les produits naturels et d'autres composés organiques abritant un époxyde adjacent à un groupe carbonyle conjugué à une fraction aromatique. Nos découvertes étendent le répertoire de la chimie connue des flavines qui peut fournir des outils nouveaux et utiles pour la synthèse organique.

Les époxydes sont des éléments constitutifs importants de la synthèse organique et de la biosynthèse1,2. En raison de la contrainte importante du cycle oxirane à trois chaînons et des liaisons oxygène-carbone polarisées, les époxydes peuvent facilement subir une ouverture de cycle régiosélective et stéréosélective sous le contrôle d'un catalyseur approprié3,4. L'ouverture du cycle époxyde se déroule généralement par addition nucléophile avec inversion de la stéréochimie ; cependant, la régiosélectivité peut être sensible au fait que la réaction soit conduite dans des conditions acides ou alcalines, comme le montre la figure 1a5. En conséquence, un certain nombre de nucléophiles ont été développés pour réagir avec des époxydes afin de donner des systèmes 1,2-difonctionnalisés avec une stéréochimie trans6. L'ouverture du cycle époxyde peut également être catalysée par des enzymes telles que les époxydes hydrolases (EH) ou les oxydoréductases (OR) (Fig. 1b)7. Les EH catalysent l'hydrolyse des époxydes en diols transvicinaux8,9 ; Les RO catalysent la réduction stéréosélective d'un époxyde en alcool (Fig. 1b)10,11.

a Réactions d'ouverture de cycle époxyde non enzymatique impliquant l'ajout d'un nucléophile (Nuc) dans des conditions basiques ou acides. b Réactions enzymatiques d'ouverture de cycle époxyde par les époxydes hydrolases (EH) et les oxydoréductases (OR). c Réactions d'ouverture de cycle époxyde de la fluostatine C (1), catalysées soit par voie enzymatique par l'hydrolase Alp1U, soit par voie non enzymatique par FAD et NADH, comme indiqué dans cette étude.

Les époxydes sont également un élément structurel important que l'on trouve dans une grande variété de produits naturels et d'intermédiaires réactifs dans les voies de biosynthèse1. En particulier, les fluostatines (FST, par exemple 1)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, les kinamycines23, les lomaiviticines24,25 et les nenestatines26,27,28 constituent une famille de angucyclines à noyau benzofluorène (Fig. 1 supplémentaire). Le noyau benzofluorène des kinamycines et des lomaiviticines est en outre décoré d'un groupe diazo conférant à ces composés de puissantes activités antitumorales qui ont attiré une attention considérable29,30. Les angucyclines atypiques sont souvent caractérisées par un cycle A hautement oxygéné qui peut subir d'autres modifications telles que l'acylation, l'époxydation, la glycosylation et la dimérisation conduisant à une diversité structurelle significative18,21,27,31,32. Il a récemment été rapporté que les hydroxylases α / β Alp1U et Lom6 catalysaient les réactions d'hydrolyse stéréosélective des époxydes lors de la biosynthèse des kinamycines et de la lomaiviticine23. Il a également été démontré que Alp1U hydrolyse l'époxyde de FST C (1) pour donner les deux FST stéréoisomères C1 (2) et C2 (3) (Fig. 1c) 18,33.

Il a été démontré que l'α / β-hydrolase FlsH de la voie FST dans le Micromonospora rosaria SCSIO N160 dérivé de la mer de Chine méridionale catalyse la désacylation des acyl FST; 18 cependant, il est incapable de catalyser l'hydrolyse de l'époxyde dans les FST malgré son homologie avec Alp1U18. Des FST naturellement isolées (Fig. 1 supplémentaire), telles que FST B12, les pyrazolofluostatines A‒C16 et FST R17, ont été proposées pour dériver des précurseurs époxydes correspondants ; cependant, étant donné l'activité de FlsH, il n'est pas tout à fait clair comment l'époxyde serait clivé et quelles enzymes, le cas échéant, seraient responsables.

Dans ce travail, il a été démontré que le cycle 2,3-époxyde du FST C (1) s'ouvre de manière non enzymatique en présence de flavine adénine dinucléotide (FAD, 4) et de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) avec FADH2 réduit (5) ou C4a- l'hydroperoxyflavine (FADOOH, 6) servant d'espèce réactive de flavine (Fig. 1c). Les réactions d'ouverture de cycle époxyde peuvent ainsi se dérouler de manière réductrice pour générer un intermédiaire énol putatif, qui est tautomérisé en produits possédant un seul groupe hydroxyle en C-2 (7 et 8), ou est encore modifié par 6 en produits avec un diol vicinal en C-2 et C-3 (3 et 9). En présence d'oxygène moléculaire, les réactions d'ouverture de cycle époxyde peuvent également se dérouler de manière oxydative conduisant à un intermédiaire peroxylé, qui peut être encore réduit par NADH à 3 et 9, ou peut subir des réarrangements de cycle pour donner des produits avec un contrat cinq- anneau A à chaînons (10) ou un anneau A à sept chaînons ponté et expansé (11). En conséquence, cette réaction de clivage époxyde non enzymatique peut expliquer la formation de plusieurs dérivés FST différents observés dans la nature. Des expériences supplémentaires montrent que des réactions similaires ont également lieu dans les produits naturels et d'autres composés organiques hébergeant un époxyde adjacent à un groupe carbonyle qui est conjugué à une fraction aromatique. Ainsi, cette réaction d'ouverture de cycle non catalysée par une enzyme est prometteuse en tant qu'outil utile en synthèse organique.

Il a déjà été démontré que l'hydroxylase α / β Alp1U hydrolysait l'époxyde de FST C (1) pour donner FST C1 (2) et FST C2 (3) (Fig. 2a, traces i-ii) 18,33. En revanche, l'homologue Alp1U FlsH est incapable de catalyser l'hydrolyse du cycle époxyde en 1 (Fig. 2a, trace iii)18. Une explication possible est que FlsH pourrait nécessiter un partenaire protéique ou un cofacteur exogène pour catalyser l'hydrolyse de l'époxyde. Afin de tester ces hypothèses, plusieurs flavines réductases dont Fre de E. coli34 ont été sélectionnées pour examiner leur compétence en tant que partenaires protéiques putatifs pour FlsH. Il a été constaté que l'incubation de FST C (1) avec FlsH et Fre en présence de NADH conduisait à de multiples produits (Fig. 2a, trace vi). Cependant, d'autres expériences ont montré que la formation du même ensemble de produits était également observée en l'absence de FlsH (Fig. 2a, trace vii), suggérant que Fre seul était capable de médier la même décomposition de FST C (1). De plus, l'incubation de 1 avec plusieurs autres flavoenzymes, notamment FlsO2 (préjadomycine oxydase)35, TiaM (tiacumicine halogénase)36,37 et XiaK (xiamycine N-hydroxylase)38 a également conduit au même résultat (Fig. 2 supplémentaire). Étant donné que les activités de ces flavoenzymes reposent toutes sur la réduction du FAD par le NADH, la flavine réduite seule a été proposée pour servir de véritable catalyseur de la consommation de FST C (1). En effet, des produits similaires ont été observés lors de l'incubation de FST C (1) avec FAD et NADH en l'absence d'enzymes, de sorte que FAD et NADH sont à la fois suffisants (Fig. 2a, traces viii & xii) et nécessaires (Fig. 2a, traces ix‒xi) pour faciliter la décomposition non enzymatique de FST C (1).

une analyse HPLC des réactions impliquant FST C (1). (i) 1 std. ; (ii) 1 + Alp1U; (iii) 1 + FlsH; (iv) 1 + FlsH + Fre; (v) 1 + FlsH + NADH; (vi) 1 + FlsH + Fre + NADH; (vii) 1 + Fre + NADH; (viii) 1 + FAD + NADH; (ix) 1 + Fre; (x) 1 + NADH; (xi) 1 + DCP ; (xii) 1 + FAD + NADH. La HPLC a été réalisée en utilisant une colonne C18 en phase inverse (i-xi) ou dans une colonne polaire (xii). Les réactions ont été effectuées pendant 30 min à 30 ° C dans du tampon PBS 50 mM (pH 7, 0) contenant 5 μM d'enzyme (s) (Alp1U, FlsH ou Fre), 100 μM FAD et 10 mM NADH. b Les structures cristallines aux rayons X de 7 et 10. c Spectre ECD expérimental de 9 (ligne noire) comparé au spectre B3LYP/TZVP PCM/MeCN // ωB97X/TZVP PCM/MeCN de (1R,2S,3R)-9 (ligne rouge). Les barres représentent les valeurs de force de rotation pour les conformateurs de solution d'énergie la plus basse.

Les produits de réaction (3 et 7‒11) ont été isolés à partir d'une réaction à plus grande échelle de FST C (1) avec FAD et NADH et caractérisés structurellement comme indiqué sur la Fig. 1c. Le premier produit a été identifié comme étant le FST C2 (3) (Fig. 3 et Tableau 1 supplémentaires), qui est également un produit de la réaction d'hydrolyse catalysée par Alp1U33. Le deuxième produit de réaction 7 (Fig. 4 et Tableau 2 supplémentaires) a été établi pour avoir la même structure plane que la FST B, une FST naturellement isolée de Streptomyces sp. TA-339112 et Streptomyces souche Acta 1383 13 ; cependant, la configuration absolue de FST B n'a pas été déterminée12. La configuration absolue (1R, 2R, 3S) de 7 a été établie par la méthodologie de solution TDDFT-ECD (Fig. 5 supplémentaire) et confirmée par analyse aux rayons X monocristallin (Fig. 2b, CCDC 2036399; Tableau supplémentaire 3). Le troisième produit 8 (Fig. 6 et tableau 2 supplémentaires) a été déterminé comme ayant la même structure plane que 7 et la configuration absolue (1R, 2R, 3R) de 8 a été attribuée par comparaison des spectres ECD expérimentaux et calculés effectués sur le stéréoisomère (1R, 2R, 3R) (Fig. 7 supplémentaire)39. Afin de distinguer les deux stéréoisomères de FST B, 7 et 8 ont été nommés FST B1 et FST B2 (Fig. 1), respectivement. Le produit 9 (appelé FST C3, Fig. 1) a été isolé avec le même temps de rétention que celui de 3 lors de l'analyse HPLC avec une colonne C18 en phase inverse. L'analyse du test à l'aide d'une colonne HPLC polaire a permis la séparation de ces deux espèces (Fig. 2a, trace xii). Enfin, 9 a été identifié comme étant un stéréoisomère de 3 par les données HRESIMS et RMN (Fig. 8 et Tableau 4 supplémentaires), et la configuration absolue (1R, 2S, 3S) de 9 a été établie par la méthodologie TDDFT-ECD (Fig. 2c , Fig. 9 supplémentaire).

Deux produits supplémentaires 10 et 11 ont également été identifiés et caractérisés structurellement (Fig.1c ; Fig. 2a, traces vi-viii & xii). Le produit 10, désigné FST C4 (Fig. 1), s'est avéré posséder un anneau A à cinq chaînons contracté par analyse spectroscopique RMN (Fig. 10 supplémentaire et tableau 5) et a été déterminé comme ayant le (1R, 2R) absolu configuration par analyse aux rayons X sur monocristal (Fig. 2b; Tableau supplémentaire 6; CCDC 2129081). Le produit 11, désigné FST C5 (Fig. 1), a été structurellement élucidé pour avoir un cycle A à sept chaînons ponté et expansé (Fig. 11 et tableau 5 supplémentaires). L'attribution de la configuration absolue (1R, 2R, 3R) à 11 était basée sur son origine à partir de 1 mais reste par ailleurs provisoire, car une caractérisation expérimentale définitive n'a pas été possible en raison de son instabilité. Actuellement, il n'existe aucun rapport indiquant que le 9‒11 a été isolé d'une source naturelle.

Pour étudier le mécanisme de la réaction d'ouverture de cycle époxyde non enzymatique, FST C (1), FAD et NADH ont été co-incubés dans un tampon PBS (pH 7,0) préparé avec de l'oxyde de deutérium (2H2O). L'incorporation d'un seul deutéron dans 7 et 8 a été indiquée par la présence d'un pic d'ion moléculaire décalé de + 1 Da à m / z 326, 7 ([M ‒ H] ‒) pour les deux produits réduits (Fig. 12 supplémentaire). En revanche, aucun changement dans les poids moléculaires de 3, 9, 10 ou 11 (Fig. 12 supplémentaire) n'a été observé. Par la suite, 7-2H et 8-2H ont été isolés à partir de réactions à plus grande échelle et analysés par RMN 1H et 13C (Figs. 13, 14 et Tableau 2 supplémentaires). La comparaison des spectres RMN 1H de 7-2H et 7 a révélé que le signal de proton 3-H de 7 avait disparu en 7-2H et que, pendant ce temps, le doublet 3-Me de 7 s'était effondré en un singulet en 7-2H (Fig. 3a ), qui a localisé 2H en C-3 de 7-2H. À l'appui de cette attribution, la corrélation COSY entre les protons H-2 et H-3 observés dans 7 était absente dans 7-2H (Figs. 4, 13 supplémentaires). De même, un singulet a également été observé pour le 3-Me ainsi que l'absence de toute corrélation COSY entre H-2 et H-3 dans 8-2H (Fig. 3a; Figs. Supplémentaires 13, 14). De plus, les spectres RMN 13C de 7-2H et 8-2H ont tous deux montré un élargissement et une intensité réduite des signaux de C-3, et des couplages 2H‒13C à C-3 ont également été observés (Figs. 13, 14 supplémentaires)40. Ces observations démontrent qu'un seul hydron de solvant est incorporé en C-3 lors de la réduction de 1 en 7 et 8.

une analyse RMN de l'incorporation de 2H ou 18O dans les produits et intermédiaires ainsi que des interconversions potentielles. L'incorporation de deutérium à partir de 2H2O en C-3 de 7 et 8 a été déduite de l'analyse spectroscopique RMN 1H. Le marquage à l'O18 dans le 3-18O et le 9-18O a été confirmé par l'analyse HRMS. Les structures attribuées de 12 et 14 sont indiquées, tandis que la structure proposée de 13 reste spéculative en raison de sa faible stabilité. b Analyse HPLC des réactions dans des conditions variables. (i) 1 std. ; (ii) 1 + FAD + NADH (dans l'air); (iii) 1 + FAD + NADH (sous 18O2); (iv) 1 + FAD + NADH (sous N2); (v) 7 dans un tampon borax/NaOH 50 mM (pH 10) à 30 °C pendant 12 h; (vi) 100 μM 1 + 10 μM FAD + 2 mM NADH (30 ° C pendant 30 min); (vii‒ix) incubation de 13 extraits de (vi) avec (vii) H2O ; (viii) DCP ; (ix) FAD + NADH ; les réactions de (viii) et (ix) ont été réalisées dans O2 à 30 °C pendant 30 min dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) ; (x) 14 dans H2O; (xi) 14 + DCP ; (xii) 14 + NADH; (xiii) 14 + FAD + NADH. Les réactions de (x-xiii) ont été réalisées à 30°C pendant 30 min. Les réactions de (xiv‒xvii) impliquaient l'incubation de 1 et de NADH avec différents cofacteurs de flavine : (xiv) FAD ; (xv) FMN ; (xvi) riboflavine; (xvii) isoalloxazine à 30 °C pendant 30 min. (xviii) La réaction contenant 1, F420, glucose 6-phosphate et FGD a été incubée à 30 ° C pendant 10 h. L'analyse HPLC a été effectuée avec une détection UV à 304 nm en utilisant une colonne polaire (traces iv et x-xviii) ou une colonne C18 en phase inverse (traces vi-ix).

Lorsque FST C (1) a été incubé avec NADH et FAD sous 18O2 (Fig. 3b, traces i−iii), l'analyse LC-MS des produits de réaction a révélé une augmentation de +2 Da de la masse moléculaire des produits oxydés donnant 3 -18O, 9-18O, 10-18O et 11-18O (Fig. 3a ; Fig. 15 supplémentaire). Ces données indiquent que la conversion de 1 en 3, 9, 10 et 11 implique l'incorporation d'un atome d'oxygène à partir de O2. De plus, la production relative de 3/9 et 10/11 versus 7/8 était dépendante de l'O2, car l'incubation de FST C (1) avec FAD et NADH après saturation du tampon de réaction avec O2 a conduit à une augmentation significative des niveaux de premier (3, 9‒11) versus second (7 et 8) ; en revanche, la saturation du tampon de réaction avec N2 a conduit à 7 et 8 comme produits dominants (Fig. 3b, traces iii et iv). Pour localiser la position exacte de l'incorporation de 18O pendant la réaction (1 → 3/9), une réaction à plus grande échelle a été réalisée en incubant 1, FAD et NADH dans un tampon PBS saturé de 18O2 (pH 7,0). Deux produits 3-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0718) et 9-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0722) (Fig. 3a ; Fig. 16 supplémentaire) ont été isolés. L'analyse RMN a montré que le marqueur 18O était incorporé en C-3 de 9-18O (Fig. 17 supplémentaire). Plus précisément, la comparaison des données de RMN 13C pour 9 et son isotopologue 18O 9-18O a démontré un décalage vers le haut de 3,8 Hz de δC-3 dans ce dernier par rapport à celui de 9 (Fig. 18 supplémentaire et tableau 4), soutenant l'étiquette 18O à C-3 (c'est-à-dire 9-18O)41,42.

La dépendance au pH de la décomposition dépendante du FAD/NADH de 1 a ensuite été étudiée en effectuant la réaction dans des tampons sur la plage de pH de 3 à 10. Après l'incubation de 100 μM de 1 avec 100 μM de FAD et 10 mM de NADH pendant 2 h à 30 ° C, 1 a été converti plus efficacement en produits à cycle ouvert époxyde avec des tampons dans la plage de pH 5 à 7; cependant, la réaction était moins efficace dans des conditions plus alcalines à des pH de 9 à 10 (Fig. 19 supplémentaire). FST B1 (7) était plutôt stable à pH 3–7; cependant, il s'est facilement converti en 8 à un pH plus élevé (Fig. 20 supplémentaire), où il a également subi une oxydation pour donner le produit naturel précédemment signalé FST A (12) (Fig. 3b, trace v; Fig. 20 supplémentaire et tableau 1) 12. FST B2 (8) était également stable à pH 3–6 et facilement converti en 7 et 12 dans des tampons plus alcalins (Fig. 20 supplémentaire). En revanche, le FST C (1) était très stable à pH 3‒10, même en présence de FAD ou de NADH seul (Fig. 21 supplémentaire), démontrant à nouveau que la décomposition de l'époxyde en 1 nécessite la présence à la fois de FAD et de NADH.

Une analyse temporelle de 100 μM 1 avec 100 μM de FAD et 10 mM de NADH a démontré la formation transitoire d'une espèce intermédiaire 13 qui a disparu après une incubation plus longue (Fig. 22 supplémentaire). Une concentration initiale fixe de 1 (100 μM) a également été incubée avec des concentrations variables de FAD (1, 10 et 100 μM) et de NADH (2, 5 et 10 mM) pendant 30 min à 30 ° C (Fig. 22 supplémentaire ). La durée de vie de l'intermédiaire transitoire a été considérablement prolongée à des niveaux réduits de FAD (Fig. 3b, trace vi). Cela a permis la collecte de l'intermédiaire 13 suivie d'une réinjection immédiate sur la HPLC démontrant sa conversion en 7 et 12 (Fig. 3b, trace vii). Lorsque l'intermédiaire 13 isolé a été immédiatement incubé avec du FAD sous O2, la production de 7 et 12 a de nouveau été observée (Fig. 3b, trace viii); cependant, si le NADH était également inclus dans l'incubation, alors 3 était plutôt observé comme produit principal avec 12 comme produit mineur, et 7 n'était plus observé (Fig. 3b, trace ix). Le spectre d'absorbance UV de l'intermédiaire 13 était très similaire à ceux de 1, 3 et 7, et l'analyse LC-MS de l'intermédiaire indiquait un m/z de 325,7 pour l'ion [M – H]– (Fig. 23 supplémentaire) . Sur la base de ces mesures, il est provisoirement proposé que l'intermédiaire soit l'énol 13 (Fig. 3b), qui est essentiellement un tautomère de 7 et 8 et a donc le même état d'oxydation que ces deux produits.

Alors que plusieurs tentatives ont été faites pour isoler l'intermédiaire afin de confirmer son affectation structurelle en tant que 13, seul 7 a été obtenu comme produit principal avec un autre composé mineur 14. Ceci est cohérent avec la faible stabilité de l'intermédiaire et sa conversion facile en 7 (Fig. 3b, trace vii, Fig. 24 supplémentaire). Néanmoins, 14 a pu être caractérisé et a donc été identifié comme le peroxyde C-3 désigné hydroperoxyfluostatine (Fig. 3a; Fig. Supplémentaire 25 et Tableau 5); cependant, une mauvaise récupération de 14 a entravé la collecte de spectres suffisants pour une caractérisation complète de sa configuration absolue à C-3. L'hydroperoxyfluostatine (14) était stable dans l'eau, même en présence de FAD (Fig. 3b, traces x et xi). Alors que la coincubation de 14 avec NADH seul a conduit à plusieurs produits 3, 9, 10 et 11, l'inclusion de FAD avec NADH n'a pas modifié le profil du produit (Fig. 3b, traces xii et xiii; Fig. 26 supplémentaire). Compte tenu de la conversion observée de 14 en 3 et 9, le composé 14 est probablement un mélange des stéréoisomères (1S, 2S, 3R) et (1S, 2S, 3S). Le fait que l'isolement de 13 ait fourni une quantité mineure de 14 suggère que 14 est un autre intermédiaire qui coélue avec 13 au lieu d'être dérivé de 13. De plus, alors que 3/9 pourraient être générés à la fois à partir de 13 et 14, 7/8 n'étaient que produits à partir de 13, alors que 10/11 étaient exclusivement issus de 14 (Fig. 3a).

Lorsque d'autres cofacteurs liés à la flavine ont été pris en compte, il a également été constaté que la FMN et la riboflavine à la place de la FAD interviennent efficacement dans la décomposition de 1 en présence de NADH (Fig. 3b, traces xiv-xvi). L'isoalloxazine et le NADH ont également pu faciliter la formation de 3 à partir de 1, mais avec une efficacité beaucoup plus faible (Fig. 3b, trace xvii). Seuls les produits 3, 9‒11 ont été observés en utilisant le cofacteur F420 en présence du système réducteur construit à partir du glucose 6-phosphate et de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (FGD) dépendante du F42043,44,45, mais surtout pas de production des espèces réduites 7 et 8 a été observée (Fig. 3b, trace xviii). L'observation de l'incorporation d'oxygène en présence de F420 et de NADH était inattendue, car la 5-déazaflavine réduite réagit généralement très lentement avec l'oxygène moléculaire46,47. Néanmoins, les résultats avec la compatibilité du cofacteur de la flavine illustrés à la Fig. 3b (traces xiv-xviii) se sont avérés reproductibles (Fig. 27 supplémentaire). Le NADPH s'est également avéré être un cofacteur efficace similaire au NADH et ainsi soutenir les réactions d'ouverture du cycle époxyde (Fig. 19 supplémentaire).

Pour explorer la généralité de cette réaction, un ensemble de dérivés FST 15‒21 (Fig. 4) ont été testés en tant que réactifs oxirane possibles. Bien que FST F (15) soit inerte vis-à-vis de Alp1U18,33, il pourrait être efficacement converti en présence de FAD et de NADH en 1-O-méthyl-FST C2 (22), 1-O-méthyl-FST B1 (23), 1-O-méthyl-FST C3 (24) et 1-O-méthyl-FST B2 (25) (Fig. 4 et Supplément Fig. 28), qui ont été caractérisés structurellement par analyse spectroscopique RMN et ECD (Tableaux supplémentaires 7, 8 et Figs. 29‒32), ainsi que l'analyse par diffraction des rayons X sur monocristal (par exemple 23, CCDCC 2036400, tableau supplémentaire 3).

Les dérivés FST 15‒20 pouvaient subir des réactions d'ouverture de cycle époxyde lors d'un traitement avec FAD/NADH pour produire plusieurs produits liés à 3, 7, 8 et 9. FST Q (21) n'était pas réactif avec FAD/NADH. Les époxydes 28–35 n'ont montré aucune activité avec FAD/NADH. Le traitement de l'auxarthrol H (36) ou de la ménadione 2,3-époxyde (37) avec FAD/NADH a donné plusieurs produits. Les époxydes 42 à 46 se sont avérés non réactifs avec FAD / NADH. L'oxydoréductase RslO5 a catalysé une réaction d'ouverture de cycle époxyde réductrice sur 43 pour produire 44 pendant la biosynthèse du rishirilide et la chalcone α,β-époxyde (46) s'est avérée être un substrat de RlsO5 pour donner le produit unique 47.

De même, la 7-O-méthyl-FST C (16), la 6-O-méthyl-FST C (17), la FST D (18), la FST S (19) et la difluostatine H (DiFST H, 20) pourraient également subir réactions d'ouverture de cycle époxyde lors d'un traitement avec FAD / NADH pour produire un ensemble de produits multiples liés à 3, 7, 8 et 9 (Fig. 4, Figs. Supplémentaires 33‒37). Les principaux produits de 16 et 17 ont été structurellement caractérisés par RMN 1D et 2D ainsi que par analyse spectroscopique ECD comme FST M (26) 17 et 6-O-méthyl-FST B1 (27), respectivement (Fig. 4, tableau supplémentaire 9 et figures 38, 39). Les structures des autres produits des réactions avec 18‒20 ont été déduites à partir d'analyses LC-MS. Notamment, FST Q (21), qui diffère de 16 en termes d'hydroxyle C-4 au lieu d'un carbonyle C-4, n'était pas réactif avec FAD/NADH (Fig. 40 supplémentaire) soulignant le rôle essentiel du carbonyle C-4 dans cette chimie.

Les époxydes 28–37 (Fig. 4) ont également été testés en tant que substrats d'oxirane putatifs. Aucune activité n'a été observée avec 28–35 (Figs. Supplémentaires 41‒46)16,40. En revanche, le traitement de l'auxarthrol H (36) 48 avec FAD / NADH a conduit à plusieurs produits (Fig. 47 supplémentaire), dont l'un a été déterminé comme étant 38, qui est un analogue structurel de l'auxarthrol F (Fig. 5; Fig. supplémentaire 48 et Tableau 10)49, par comparaison avec les spectres ECD expérimentaux et calculés de 36 et 38 (Fig. 49 supplémentaire). La réaction avec la ménadione 2,3-époxyde (37) a donné trois produits (tableau supplémentaire 11 et fig. 50‒53), dont la 3-hydroxy-3-méthyl-2,3-dihydronaphtalène-1,4-dione (39), 2 -hydroxy-3-méthyl-1,4-naphtoquinone (40, phthiocol, caractérisé par diffraction des rayons X, CCDC 2036401; Tableau supplémentaire 12), et 3-méthylnaphtalène-1,4-dione (41).

La réaction peut se dérouler via des voies réductrices et oxydatives conduisant à de multiples produits d'états redox différents en fonction de la présence de NADH et d'O2. Il est proposé que les transformations clés dans les réactions réductrices (fond jaune) impliquent un adduit de flavine N5‒C4′ (49) pour produire l'énol intermédiaire 13, qui peut subir une tautomérisation pour donner 7 (majeur) ou 8 (mineur), et une oxydation produire 3 (majeur) ou 9 (mineur). 7 peut être encore auto-oxydé en 12. Alors que l'ouverture du cycle oxydatif est susceptible d'impliquer un adduit de flavine C4a‒O‒O‒C3′ (50) pour donner l'intermédiaire peroxylé 14 (fond gris), qui peut subir une réduction en 3 et 9 par NADH, et d'autres réarrangements menant à 10 et 11.

Deux caractéristiques structurelles communes partagées par tous les composés qui peuvent réagir avec FAD/NADH pour subir les réactions d'ouverture de cycle époxyde comprennent (i) la présence d'un carbonyle adjacent à l'époxyde et (ii) la présence d'une fraction aromatique adjacente au carbonyle/ paire époxyde (Fig. 4). L'absence d'un groupe carbonyle voisin du cycle époxyde en 21 et 28–31 peut expliquer le manque de réactivité observé. Alors que 36 et 37 ont subi une ouverture de cycle en présence de FAD/NADH, aucune réaction n'a été observée pour 32–35 malgré la présence d'une paire époxyde/carbonyle dans ces composés. Cela implique que la conjugaison de la paire carbonyle/époxyde à un système aromatique est également nécessaire pour l'ouverture du cycle de l'époxyde.

Le composé commercial vitamine K1 2,3-époxyde (42) a également été testé en tant que substrat putatif, qui comporte à la fois une paire époxyde/carbonyle et un cycle aromatique adjacent. Cependant, l'incubation de 42 avec FAD / NADH n'a entraîné aucune modification de son profil de rétention TLC ou de ses propriétés spectroscopiques n'impliquant aucune réaction (Fig. 54 supplémentaire). Une étude récente a démontré que la flavoenzyme RslO5 catalysait une réaction d'ouverture de cycle époxyde réductrice médiée par un hydrure pour convertir 43 en 44 lors de la biosynthèse du rishirilide (Fig. 4)11. La réaction s'est déroulée d'une manière très similaire à la conversion de 1 en 7. Cependant, la production de 44 à partir de 43 a été confirmée comme étant strictement dépendante de RslO5 et 43 n'était pas réactive en présence de FMN et de NADH11. Une explication possible est que la présence d'une longue chaîne latérale à côté de l'époxyde dans 42 et 43 pourrait entraver à la fois l'approche et l'orientation de la flavine, empêchant ainsi les interactions appropriées pour l'ouverture du cycle (Fig. 55 supplémentaire). Deux autres composés commerciaux trans-1,3-diphényl-2,3-époxypropan-1-one (45) et chalcone α,β-époxyde (46) se sont avérés non réactifs avec le FAD/NADH ; cependant, 46 mais pas 45 a été accepté comme substrat par RlsO5 pour donner le produit unique 47 (tableau supplémentaire 13 et figures 56, 57), ce qui indique que RslO5 est spécifique d'un seul des deux énantiomères. L'incorporation de deutérium dans 47 n'a pas été observée à partir de la réaction RslO5 dans du 2H2O tamponné, mais a effectivement été observée lors de la réalisation de la réaction RslO5 dans un test couplé soit avec la glucose déshydrogénase de Bacillus megaterium DSM 2894 (BmGDH) pour fournir (S)-[4- 2H]NADH50, ou avec la glucose déshydrogénase de Thermoplasma acidophilum ATCC 25905 (TaGDH) pour fournir (R)-[4-2H]NADH51, respectivement, en utilisant du d-[1-2H]glucose comme donneur de deutérium (Fig. 58 supplémentaire )52. Des études antérieures ont démontré que le mutant RslO5-H172N présentait un déficit de liaison FMN et était inactif avec le substrat natif 4311, suggérant le rôle critique de FMN dans la réaction catalysée par RslO5. Pris ensemble, un hydrure de FMNH2 provenant de NADH est proposé comme étant le nucléophile efficace pour les réactions d'ouverture d'époxyde catalysées par RslO5. En revanche, aucune incorporation de deutérium dans 7 n'a été observée dans les réactions de 1 et de FAD avec (S)-[4-2H]NADH ou (R)-[4-2H]NADH généré comme décrit ci-dessus (Figures supplémentaires 58, 59 ). Par conséquent, la réduction non enzymatique de 1 à 7 en présence de FAD/NADH diffère de celle de la catalyse RslO5 en ce qui concerne l'origine ultime de l'hydrogène C-3.

Les réactions d'ouverture de cycle époxyde sont courantes et importantes dans les processus biologiques et les applications synthétiques1,2. Les réactions d'ouverture de cycle époxyde non enzymatiques sont généralement redox neutres par addition nucléophile avec la régiosélectivité et la stéréosélectivité préférées en fonction de la nature de l'époxyde et des conditions de réaction pour donner généralement des produits avec un diol trans-vicinal3,4. Une chimie similaire est rencontrée parmi les hydrolases α / β-époxyde qui génèrent également des produits diols trans-vicinaux53. Par exemple, l'hydrolase AlpU catalyse l'hydrolyse de l'époxyde de l'époxyde FST C (1) pour donner 2 et 3, dont chacun présente un diol trans-vicinal (Fig. 1)33. En revanche, il a été récemment rapporté que la flavoenzyme RslO5 catalyse une ouverture de cycle époxyde réductrice du rishirilide, donnant ainsi un produit monohydroxylé11. La chimie de RslO5 est donc nettement différente de celle des réactions hydrolytiques précédemment rapportées et représente à la place l'hydrogénation d'un époxyde par la flavine réduite, ce qui ressort des résultats utilisant des substrats marqués isotopiquement (Fig. 58 supplémentaire).

Dans cette étude, il a été démontré que FAD/NADH induisait l'ouverture du cycle d'époxydes activés de manière appropriée, conduisant à une variété de produits avec différents états redox. Dans des conditions anaérobies, l'ouverture du cycle époxyde se déroule de manière réductrice en présence de FAD/NADH via un mécanisme qui peut être sans rapport avec celui de la catalyse RslO5. Les espèces monohydroxylées résultantes, cependant, sont très sensibles à l'oxydation par l'oxygène moléculaire entraînant des quinones (par exemple, 12) et des alcools vicinaux dans des réactions qui peuvent également être accélérées par la présence de FAD. Dans des conditions aérobies, l'ouverture du cycle époxyde semble se dérouler par la formation d'une espèce α-cétoperoxylée qui peut être réduite par le NADH pour générer à nouveau des diols vicinaux. En variante, l'intermédiaire peroxylé peut subir un réarrangement supplémentaire conduisant à la fois à des produits oxydés à cycle contracté (par exemple, l'espèce à cinq chaînons 10) ainsi qu'à cycle expansé (par exemple, l'espèce à sept chaînons 11).

Sur la base des preuves expérimentales accumulées, un mécanisme putatif est proposé pour les réactions d'ouverture de cycle époxyde non enzymatiques activées par FAD / NADH (Fig. 5). Étant donné que le FAD et le NADH en excès sont nécessaires pour les réactions d'ouverture de cycle époxyde observées, le NADH est proposé comme réducteur, le FAD servant de catalyseur redox. Lorsque la réaction est conduite en aérobiose, O2 est proposé comme oxydant. Étant donné que le NADH seul ne pouvait pas initier la réaction, il est proposé que la flavine réduite soit l'espèce directement responsable de la réduction de 1. Il est possible que 7 soit directement formé via un transfert d'hydrure à partir d'une espèce de flavine réduite (par exemple, N5-H de FADH2) à C3 de 1 ouvrant ainsi le cycle époxyde, ce qui ressemblerait à la réaction de réduction d'époxyde catalysée par RslO5 (Fig. 4). Dans ce cas, l'observation que le produit 7 a son H-3 dérivé du solvant pourrait être expliquée par un échange facile de N5-H de la flavine réduite avec le solvant. Cela impliquerait que 7 devrait être le produit de réduction immédiat avant la tautomérisation en l'intermédiaire observé 13. Cependant, un essai temporel utilisant 0,5 μM 1 avec 10 μM FAD et 2 mM NADH a démontré que 13 s'accumule d'abord suivi d'une conversion en 7 et 8 En revanche, aucune accumulation significative de 13 n'a été observée lors d'incubations de 7 dans des conditions similaires (Fig. 60 supplémentaire). Ces résultats impliquent que 13 est le produit de réduction initial plutôt que 7 ou 8, et donc la réduction non enzymatique de 1 en présence de FAD/NADH ne procède pas par transfert direct d'hydrure vers C-3 comme cela est proposé pour la catalyse RslO5.

Un mécanisme alternatif implique l'activation de l'oxirane par le carbonyle adjacent couplé à un cycle aromatique et subit une réduction conduisant à un intermédiaire instable. Il est peu probable que cet intermédiaire soit le 7-déméthyl-FST Q (48) (Fig. 4), qui est le produit d'une réduction directe du carbonyle C-4 en 1, car le FST Q (21) 17 précédemment isolé est inerte vis-à-vis de la Système de réaction FAD/NADH (Fig. 40 supplémentaire). Au lieu de cela, l'intermédiaire lors de la réduction de FST C (1) est supposé être une espèce énol telle que 13, ce qui est cohérent avec l'observation selon laquelle 13 se tautomérise facilement pour donner 7 et 8. Ce mécanisme est également cohérent avec l'incorporation de deutérium à H-3 de 7 et 8 lorsque la réaction est effectuée dans 2H2O. Le composé 13 devrait également être sensible à l'auto-oxydation pour donner 3 et 9 d'une manière sensible à la présence d'O2, de FAD et de NADH.

La formation de 13 peut se faire via l'ajout du N-5 nucléophile de la flavine réduite à 1. Ce modèle est étayé par le fait qu'aucune formation de 7 n'a été observée en utilisant le cofacteur F420 réduit, qui n'a pas le N-5 nucléophile mais est encore capable de servir de donneur d'hydrure54. L'addition nucléophile de FADH2 à 1 peut se produire en C-3 ou en C-4. Compte tenu de la présence d'un groupe CH3 stériquement volumineux en C-3 de 1, il est proposé que C-4 soit le site probable d'une attaque nucléophile, ce qui est cohérent avec l'exigence d'un carbonyle adjacent à l'époxyde et donc la réactivité différente de 16 (C-4 carbonyle) contre 21 (C-4 hydroxyle). Considérant que N-5 dans FADH2 possède une paire isolée et que C-4 dans 1 est un carbone carbonyle trigonal, il est proposé que la réaction redox se produise via une interaction n → π *. Plus précisément, le N-5 nucléophile donne la densité d'électrons de la paire isolée (n) au centre trigonal du carbène (orbitale π * vide) le long de la trajectoire de Burgi – Dunitz55. Le mélange de ces orbitales est thermodynamiquement favorable résultant en un adduit covalent 49 (Fig. 5) 56. La déprotonation N-1 ultérieure de la fraction flavine dans 49 conduit à la rupture de la liaison N5‒C4 'et à la libération de la flavine oxydée, complétant ainsi la réduction de 1 en énol intermédiaire 13 avec une double liaison Δ3,4 (Fig. 5 ).

L'intermédiaire 13 est très instable et subit une tautomérisation facile pour incorporer un solvant hydron au niveau du carbone α (C-3) soit de la face si (la voie principale) soit de la face re (la voie mineure) de la structure plane sp2, pour donner 7 ou 8, respectivement57. Ce mécanisme est cohérent avec l'incorporation spécifique au site de deutérium en C-3 en 7 et 8 à partir de 2H2O tamponné (Fig. 3a). Malgré la configuration 2,3-cis de 7 par rapport à 8, le premier semble être le tautomère favorisé thermodynamiquement avec une constante d'équilibre d'environ [7]eq/[8]eq = 5,4 (Fig. 61 supplémentaire). De plus, 7, 8 et l'intermédiaire énol putatif 13 sont également susceptibles d'auto-oxydation pour donner 12 (Fig. 62 supplémentaire).

L'énol intermédiaire putatif 13 semble également être sensible à l'oxygène moléculaire et peut subir une auto-oxydation en présence de FAD et de NADH. La flavine réduite est connue pour réagir avec O2 pour former l'adduit covalent Fl4aOOH (FAD → FADOOH)58, et dans certains cas, H2O2 peut être libéré de FADOOH pour servir d'oxydant37,59. Cependant, ni 1 ni 13 ne peuvent réagir avec H2O2 (Figures supplémentaires 24, 63). Ainsi, il est proposé que l'intermédiaire 13 réagisse avec le groupe électrophile C(4a)-hydroperoxy de FADOOH pour donner les produits monooxygénés en C-3 (voir Fig. 64 supplémentaire). L'hydroxylation peut se produire soit à partir de la face si (voie principale) ou de la face re (voie mineure) de la double liaison planaire (Δ3,4) pour produire 3 ou 9, respectivement, avec libération concomitante de la flavine oxydée (Fig. 5) . Le mécanisme proposé est étayé par les observations selon lesquelles (i) l'O incorporé à la fois dans 3 et 9 en C-3 provient de O2, et (ii) la conversion de 13 en 3 et 9 nécessite la présence de FAD, NADH et O2.

L'isolement de l'intermédiaire 14 indique que 3 et 9 peuvent également être produits d'une manière alternative qui n'implique pas 13. En présence d'oxygène moléculaire, le peroxyde de flavine C (4a) (FADOO‒) peut servir de nucléophile pour attaquer régiosélectivement C-3 sur 1 au niveau de la face si (voie principale) ou de la face re (voie mineure) pour ouvrir le cycle époxyde, résultant en l'adduit putatif 50 (Fig. 5). La présence de l'oxygène carbonyle C-4 avec effet attracteur d'électrons peut provoquer des changements de la densité électronique de C-360, pour faire de C-3 un meilleur site pour les substitutions nucléophiles que C-2 de l'époxyde en 1. Déprotonation du la flavine N-5 dans 50 rompt la liaison covalente C4a‒O pour libérer 14 et FAD (Fig. 5). Le produit 14 est un mélange d'isomères C-3 et facilement réduit en 3 et 9 par le NADH (Fig. 5, Fig. 65 supplémentaire). La coincubation de 14 avec NADH conduit également à 10 et 11, ce qui est proposé pour impliquer un mécanisme de type réaction de Baeyer-Villiger. L'hydroperoxyde C-3 dans 14 peut ainsi effectuer une addition nucléophile intramoléculaire au niveau du carbonyle C-4 pour former l'intermédiaire putatif 51, qui peut se répartir pour générer 10 et 11. Dans le premier cas, l'intermédiaire 51 peut subir un réarrangement de Criegee pour donner un cycle lactone à sept chaînons61,62, suivi d'une addition intramoléculaire de l'hydroxy C-1 au carbonyle C-4 qui conduit à 10 après déshydratation (Fig. 5)63. Alternativement, l'unité 1,2-dioxétane de 51 peut subir un clivage hétérolytique, suivi d'une fragmentation de type Grob pour donner un intermédiaire oxoheptanoate64,65, qui génère finalement l'hémiacétal 11 après des cyclisations intramoléculaires successives et une déshydratation66.

En conclusion, il est suggéré que l'ouverture du cycle époxyde réducteur se déroule de manière mécanique via un adduit transitoire (49) avec une liaison covalente N5‒C4' qui se forme entre N-5 du cofacteur flavine et C-4 du substrat FST C ( 1) (fig. 5). Alors que la tautomérisation du produit résultant peut donner 7 et 8, la réaction nucléophile avec FADOOH peut également donner les produits diols 3 et 9. L'ouverture du cycle époxyde oxydatif de 1 produit l'intermédiaire 14 via un adduit covalent putatif C4a‒O‒O‒C3' ( 50, figure 5). La réactivité canonique des cofacteurs de la flavine implique une chimie redox par transfert d'hydrure N-5 ou activation de l'oxygène en C-4a dans la majorité des cas67. Cependant, il a été rapporté que quelques flavoenzymes catalysent la formation d'adduits covalents de flavine N-5‒substrat de manière redox neutre68, avec des exemples incluant les adduits d'iminium dans le cycle catalytique de l'UDP-galactopyranose mutase69, alkyl-dihydroxyacétone phosphate synthase70 , la flavine prényltransférase71, la thymidylate synthase72 et la 2-haloacrylate hydratase73.

La présente étude fournit un exemple impliquant probablement la formation d'adduits de flavine N-5 au cours de réactions non enzymatiques catalysées par la flavine (Fig. 5). De plus, en plus de servir de nucléophile dans la médiation de l'hydroxylation, de l'époxydation et de l'oxydation de Baeyer-Villiger dans la catalyse des flavoenzymes58, le peroxyde de flavine C (4a) (FADOO‒) est proposé pour faciliter également la formation d'intermédiaires peroxylés tels que 14 (Fig. . 5). La flavine et les dérivés de la flavine sont bien connus pour participer en tant que cofacteurs dans une grande variété de réactions trouvées dans la nature67,74. Des rapports antérieurs ont montré que les flavines naturelles peuvent catalyser la décarboxylation oxydative non enzymatique des dérivés de l'acide picolinique75 et l'iodation non enzymatique de divers composés aromatiques37,59. Dans cette étude, la chimie des flavines est étendue aux réactions d'ouverture de cycle époxyde à la fois de manière réductrice et oxydative pour générer plusieurs produits à cycle ouvert. Par conséquent, la chimie des flavines identifiée dans cette étude peut être applicable à d'autres époxydes et est donc prometteuse en tant qu'outil utile en synthèse organique.

La souche Micromonospora rosaria SCSIO N160 a été utilisée pour l'isolement des FST15. FST Q (21) a été précédemment isolé de Streptomyces sp. PKU-MA0004517. Des produits chimiques, des enzymes et d'autres réactifs de biologie moléculaire ont été achetés auprès de sources commerciales standard et utilisés selon les recommandations du fabricant.

L'analyse HPLC des réactions a généralement été effectuée sur un instrument de la série Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies Inc., USA) en utilisant une colonne C18 en phase inverse (Kinetex® 5 µm C18 100 Å, LC Column 150 × 4,6 mm, Phenomenex, USA) ou une colonne polaire (Comixsep®, P/N FMG-BPF5-EONU, Polar BiPFP 5 u, 250 × 4,6 mm, Chine) avec détection UV à 256 ou 304 nm sous le programme suivant : solvant A, 10% acétonitrile (MeCN) dans de l'eau additionnée d'acide formique à 0,1 % ; solvant B, 90 % MeCN dans l'eau ; 5 % B à 80 % B (0–20 min), 80 % B à 100 % B (20–21 min), 100 % B (21–24 min), 100 % B à 5 % B (24–25 min ), 5 % B (25–30 min) ; débit à 1 mL min−1.

Le fragment d'ADN de rslO5 (GenBank : KJ437438.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1]) du groupe de gènes biosynthétiques du rishirilide chez Streptomyces bottropensis11 a été synthétisé et cloné dans pET28a pour donner le plasmide pCSG8112 (tableau supplémentaire S14). Lorsque les cultures d'E. coli BL21(DE3)/pCSG8112 dans un milieu LB contenant de la kanamycine (50 μg mL−1) ont atteint une DO600 d'environ 0,6 à 37 °C, la production de RslO5 a été induite par l'ajout d'isopropyl- β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,1 mM. Les cultures ont été cultivées à 16 °C pendant 12 h supplémentaires. Les cellules ont ensuite été recueillies par centrifugation et ont été remises en suspension dans le tampon de lyse (Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM et imidazole 5 mM, pH 8,0) pour la sonication. La purification de RslO5 marqué avec N-His6 a été réalisée en utilisant une chromatographie d'affinité Ni-NTA conformément au manuel du fabricant (Novagen, USA). Après dessalage avec la colonne PD-10 (GE Healthcare, USA), le RslO5 purifié a été stocké dans le tampon de stockage (10 % glycérol, 1 mM DTT, 50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, pH 8,0) à -80 °C pour une utilisation ultérieure. L'expression et la purification de Fre34, Alp1U18, FlsH18, XiaK38, TiaM36 et FlsO235 ont été effectuées comme décrit pour RslO5. Les dosages enzymatiques in vitro standard (Alp1U, FlsH, Fre, XiaK, TiaM, Fre ou FlsO2) contenaient 100 μM de FST C (1) et 10 μM d'enzyme recombinante purifiée dans un tampon PBS (phosphate buffered saline) 50 mM (pH 7,0 ) dans un volume total de 100 μL avec incubation à 30 °C pendant 0,5 à 2 h. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant 100 μL de MeOH glacé et ont été suivies en utilisant les méthodes analytiques générales de HPLC.

Un mélange réactionnel typique comprenait 100 µM 1, 100 µM FAD et 10 mM NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 µL avec incubation à 30 °C pendant 0,5 à 2 h. En général, les réactions ont été terminées en ajoutant 100 µL de MeOH glacé et analysées par HPLC en utilisant la méthode HPLC analytique générale ou soumises à une analyse LC-MS. Pour les réactions dans des conditions anaérobies, les tampons de réaction ont été rincés au N2 pendant 5 min avant d'en ajouter 1, scellés à l'aide de Parafilm et rincés au N2 pendant l'incubation à 30 ° C pendant 30 min. Pour les réactions dans des conditions aérobies, les tampons de réaction ont été rincés à l'O2 pendant 5 min avant d'en ajouter 1, scellés à l'aide de Parafilm et rincés à l'O2 pendant l'incubation à 30 ° C pendant 30 min. Pour les réactions de marquage isotopique avec 2H, chaque réaction a été effectuée dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) préparé avec de l'eau deutérée (2H2O). Pour les réactions de marquage isotopique avec 18O2, un mélange réactionnel contenant 100 µM de FAD et 10 mM de NADH dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) a été dégazé et rincé avec 18O2 pendant 5 min ; après l'ajout de 100 µM 1, du gaz 18O2 a été barboté en continu dans le mélange réactionnel pendant 2 h à température ambiante avec agitation occasionnelle.

Pour déterminer les effets du pH sur les réactions, les dosages ont été effectués dans un volume total de 100 μL contenant 100 μM 1, 100 μM FAD et 10 mM NADH dans des tampons 50 mM avec des valeurs de pH allant de 3 à 10 avec incubation à 30 °C pendant 2h. Les tampons ont été préparés comme suit : tampon acide citrique/Na2HP04 (pH 3-6) ; Tampon PBS (pH 7) ; tampon acide borique/borax (pH 8‒9), tampon borax/NaOH (pH 10). En tant que témoins, 100 μM 1 ont été incubés dans différents tampons de pH (pH 3 à 10) en présence de 100 μM de FAD seul (ou de 10 mM de NADH seul) à 30 ° C pendant 2 h.

Pour le test temporel, les réactions ont été réalisées en incubant 100 µM 1, 100 µM FAD et 10 mM NADH dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) à 30 °C avec échantillonnage à différents moments de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25 et 30 min. Pour tester les effets de différentes concentrations de FAD/NADH, des réactions ont été réalisées avec 100 uM de tampon PBS 50 mM (pH 7,0) avec différentes concentrations de FAD et de NADH. La première série de réactions a été menée avec 100 μM de FAD 1, 1 μM et 2 (ou 5 ou 10 mM) de NADH. La deuxième série de réactions a été réalisée avec 100 μM de FAD 1, 10 μM et 2 (ou 5 ou 10) mM de NADH. La troisième série de réactions a été réalisée avec 100 μM 1, 100 μM FAD et 2 (ou 5 ou 10) mM NADH. Les mélanges réactionnels ont été incubés dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) à 30 °C pendant 30 min.

Pour tester la compatibilité des cofacteurs, des dosages contenant 100 μM de 1, 100 μM de FAD (ou FMN/riboflavine/isoalloxazine) et 10 mM de NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 μL ont été incubés à 30 °C pendant 30 minutes. Pour tester le F420 en tant que cofacteur, dosages contenant 100 μM de 1 200 μM de F420, 2,5 mM de glucose-6-phosphate, 10 μM de glucose-6-phosphate déshydrogénase (FGD) dépendante du F420 dans du tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 ) dans un volume total de 100 μL ont été incubés à 30 °C pendant 1 h.

Les réactions d'ouverture de cycle époxyde médiées par FAD / NADH ont été testées avec divers substrats, y compris des substrats liés à la FST 15‒21 et des substrats non liés à la FST 28–37, 42, 45 et 46. Un mélange réactionnel typique contient 100 µM de substrat (15 ‒21, 28–37, 42, 45 ou 46), 100 µM FAD et 10 mM NADH dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 µL.

Pour tester la réactivité de H2O2 avec le FST C (1), les dosages ont été réalisés dans un volume total de 100 μL contenant 100 μM 1 et 30% H2O2 dans des tampons 50 mM à pH 3,0 (ou pH 7,0 ou pH 10,0) par incubation à 30°C pendant 2h.

Une réaction à plus grande échelle de 1 dans un volume total de 1 L a été réalisée dans un tampon PBS 50 mM (pH 7, 0) contenant 100 μM 1, 10 mM NADH et 100 μM FAD à 30 ° C pendant 2 h avec agitation occasionnelle. La réaction a été stoppée par l'ajout d'un volume égal de butanone glacée et centrifugée à 2057 × g pendant 20 min à 4 °C. Les mélanges réactionnels ont ensuite été extraits trois fois avec un volume égal de butanone et les solvants ont été éliminés sous vide sur un bain de glace. Les extraits bruts ont été dissous dans 1,5 mL de MeOH et soumis à une CLHP semi-préparative à l'aide d'une colonne Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm × 9,4 mm, 5 μm ; Agilent Technology Ltd., USA) avec un gradient d'élution isocratique de 70 % A (H2O avec 0,8 % d'acide formique) et 30 % de B (MeCN) à un débit de 2,5 mL min-1. Ainsi, les composés 3 (8,5 mg, 22,0 %), 7 (22,0 mg, 57,0 %), 8 (6,0 mg, 15,5 %), 9 (2,6 mg, 6,7 %), 10 (1,6 mg, 4,1 %) et 11 (3,4 mg, 8,8 %) ont été obtenus. De même, une échelle de réaction de 40 mL avec 100 μM de FST F (2) a donné 22 (2,0 mg, 15 %), 23 (6,0 mg, 46,0 %), 24 (0,9 mg, 7,0 %) et 25 (1,2 mg, 9,0 %). Les réactions à l'échelle de 30 mL de 16, 17 ou 36 ont donné 26 (1,3 mg, 44,0 %), 27 (1,5 mg, 46,0 %) ou 38 (1,3 mg, 67,0 %), respectivement. Une réaction à l'échelle de 30 mL de 37 a donné 39 (1,8 mg, 11,0 %), 40 (4,8 mg, 30,0 %) et 41 (4,3 mg, 27,0 %).

Pour l'isolement de 3-18O et 9-18O, une réaction à l'échelle de 400 mL de 1 a été réalisée sous 18O2, consistant en 100 µM 1, 100 µM FAD et 10 mM NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) par incubation à 30°C pendant 2h. Les produits de réaction ont été purifiés par HPLC semi-préparative comme décrit ci-dessus pour donner 3-18O (3,0 mg, 33,0%) et 9-18O (1,2 mg, 16,0%). Pour l'isolement de 7-2H et 8-2H, une réaction à l'échelle de 400 mL de marquage isotopique avec 2H a été mise en place dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) préparé avec du 2H2O tamponné, contenant 100 µM 1, 100 µM FAD, et NADH 10 mM, par incubation à 30 °C pendant 2 h. Les produits de réaction ont été purifiés par HPLC semi-préparative pour donner 7-2H (11,5 mg, 65,0 %) et 8-2H (3,2 mg, 19,0 %).

Un mélange réactionnel contenant 100 µM 1, 10 µM FAD et 2 mM NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 µL a été incubé sous une atmosphère normale à 30 °C pendant 20 min. Les réactions ont été désactivées en ajoutant 100 μL de MeOH glacé. Pour vérifier la stabilité de 13, l'intermédiaire 13 a été collecté à partir d'un cycle HPLC analytique général et a été immédiatement réinjecté pour analyse HPLC. De même, pour surveiller les changements de 13 dans diverses conditions, le 13 fraîchement collecté a été immédiatement incubé dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) contenant (i) 10 µM de FAD ; (ii) 30 % H2O2 ; (iii) NADH 2 mM; (iv) FAD 10 µM et NADH 2 mM (en présence d'un excès d'O2) à 30 °C pendant 30 min. Les réactions ont été désactivées en ajoutant 100 μL de MeOH glacé et contrôlées par la méthode HPLC analytique générale en utilisant une colonne C18 ainsi qu'une colonne polaire.

Des réactions à plus grande échelle dans un volume total de 50 mL (100 µL × 500 tubes Eppendorf) ont été réalisées contenant 100 µM 1, 10 µM FAD et 2 mM NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) à 30 °C pendant 20 min avec le but d'isoler 13 pour l'élucidation de la structure. Les réactions dans chaque tube Eppendorf ont été stoppées par trois extractions avec 100 µL de butanone glacée et les solvants ont été éliminés sous vide sur un bain de glace. Les extraits bruts ont ensuite été collectés et dissous dans 1,0 ml de MeOH et soumis à une HPLC analytique générale en utilisant une colonne polaire. Les collections ont été conservées à -80 ° C avant la lyophilisation. Les fractions collectées ont été purifiées une seconde fois pour éliminer 7, qui avait été généré à partir de la décomposition de 13. Ce processus a finalement donné un composé pur et stable (0,8 mg), qui a été dissous dans du DMSO-d6 pour analyse RMN et confirmé comme étant 14.

Un ensemble d'essais a été effectué pour vérifier la stabilité de 14. Un mélange réactionnel typique comprenait 100 µM de 14, 10 µM de FAD et 2 mM de NADH dans du tampon PBS 50 mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 µL. Les réactions témoins ont été réalisées en parallèle en omettant le FAD ou le NADH dans les dosages. Une co-incubation de 100 µM de 14 dans 30 % de H2O2 a également été effectuée dans un volume total de 100 µL. Les mélanges réactionnels ont été incubés à 30°C pendant 30 min. Les réactions ont été désactivées après l'ajout de 100 μL de MeOH glacé et ont été analysées par HPLC en utilisant une colonne polaire selon la méthode HPLC analytique générale.

Un mélange réactionnel in vitro standard de RslO5 contenait 100 μM de trans-1,3-diphényl-2,3-époxypropan-1-one (45) ou de chalcone α,β-époxyde (46), 10 μM de RslO5 et 5 mM de NADH dans 50 Tampon PBS mM (pH 7,0) dans un volume total de 100 μL et incubé à 30 °C pendant 2 h. La réaction avec 46 a également été réalisée dans un tampon PBS 50 mM (pH 7,0) préparé avec de l'eau deutérée (2H2O) et soumise à une analyse LC-HRESIMS pour étudier l'incorporation de 2H dans 47 à partir du solvant. Pour isoler 47 pour l'élucidation structurelle, des réactions de 15 ml ont été effectuées dans un tampon PBS 50 mM (pH 7, 0) contenant 100 μM 46, 10 μM RslO5 et 5 mM NADH à 30 ° C pendant 6 h. La réaction a été désactivée avec un volume égal de butanone prérefroidi. Après centrifugation à 2057 × g pendant 20 min à 4 °C, les surnageants ont été extraits trois fois avec un volume égal de butanone pré-réfrigéré. La butanone a été éliminée sous vide sur un bain de glace. Les extraits bruts ont été dissous dans 500 μL de MeOH et ont été purifiés par HPLC semi-préparative à l'aide d'une colonne C18 (250 mm × 10,0 mm, 5 μm ; Phenomenex, USA), avec un gradient d'élution isocratique de 60 % A (H2O avec 0,8 % acide formique)/40 % B (MeCN) à un débit de 2,5 mL min-1 pour donner 47 (3,0 mg, 41,0 %).

La purification des d-glucose déshydrogénases BmGDH de Bacillus megaterium DSM 2894 dans E. coli BL21(DE3)/pRSF-BmGDH et TaGDH de Thermoplasma acidophilum dans E. coli BL21(DE3)/pCSG3622, a été réalisée selon notre étude précédente76. Dans le cas des tests de couplage RslO5/GDH, la réduction du NADP en NADPH a d'abord été réalisée dans une réaction de 100 μL contenant 10 μM de TaGDH (ou BmGDH), 2 mM de NADP et 100 mM de [1-2H]d-glucose dans 50 mM tampon phosphate de sodium (pH 7,0) par incubation pendant 1 h à 37 ° C pour BmGDH ou 50 ° C pour TaGDH, suivie de l'ajout de 100 μM 46 et 10 mM RslO5 et incubation supplémentaire à 30 ° C pendant 6 h. Le NADH marqué au 2H généré in situ a également été mis à réagir avec 1 et FAD pour surveiller l'incorporation de 2H dans le produit 7. Les réactions ont été désactivées avec un volume égal de MeOH glacé et analysées par LC-HRESIMS à l'aide de l'analyseur général. Méthode CLHP.

Des recherches conformationnelles mixtes torsion/mode bas ont été réalisées à l'aide du logiciel Macromodel 10.8.011 en utilisant le MMFF avec un modèle de solvant implicite pour le CHCl3 appliquant une fenêtre d'énergie de 21 kJ/mol77. Des ré-optimisations de la géométrie des conformères résultants ont été effectuées au niveau de ωB97X/TZVP avec le modèle de solvant PCM pour MeCN. Les calculs TDDFT ECD ont été effectués avec Gaussian 09 pour ECD en utilisant diverses fonctionnelles (B3LYP, BH&HLYP, CAM-B3LYP, PBE0) et la base TZVP avec le même modèle de solvant que dans l'étape d'optimisation DFT précédente78. Les spectres ECD ont été générés comme la somme des gaussiennes avec des largeurs à mi-hauteur de 3000 et 3600 cm−1, en utilisant des valeurs de force de rotation calculées par la vitesse du dipôle79. Les distributions de Boltzmann ont été estimées à partir des énergies ωB97X. Le progiciel MOLEKEL a été utilisé pour la visualisation des résultats80.

Un monocristal de 7, 10 et 23 a été obtenu dans un solvant mixte de MeOH et d'eau, et des monocristaux de 40 ont été obtenus dans un solvant mixte de CH3CN et H2O. Les cristaux appropriés ont été sélectionnés et les données cristallines ont été enregistrées sur un diffractomètre unique XtaLAB AFC12 (RINC): Kappa, avec un rayonnement Cu Kα (λ = 1, 541 84 Å). Les cristaux ont été maintenus à 99,9(7) K pendant 7, 99,8(9) K pendant 23, 100,00(10) K pendant 10 et 100,01(12) K pendant 40 pendant la collecte des données. En utilisant Olex281, la structure a été résolue avec le programme de solution de structure ShelXT82 en utilisant la mise en phase intrinsèque et raffinée avec le package de raffinement ShelXL en utilisant la minimisation des moindres carrés.

Les données et le code de ce manuscrit ont été déposés de manière appropriée dans un référentiel de données public ou fournis dans les informations supplémentaires pour la mise à disposition du public. Les données cristallographiques peuvent être obtenues gratuitement pour 7 (CCDC 2036399), 10 (CCDC 2129081), 23 (CCDC 2036400) et 40 (CCDC 2036401) via www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif, ou par en envoyant un e-mail à [email protected], ou en contactant The Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, Royaume-Uni ; fax : +44 1223 336033. Le numéro d'accès GenBank pour le fragment d'ADN de rslO5 est KJ437438.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1).

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Ces auteurs ont contribué à parts égales : Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang.

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Université de l'Académie chinoise des sciences, 19 Yuquan Road, Pékin, 100049, Chine

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Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Yiguang Zhu et Changsheng Zhang

Département de chimie organique, Université de Debrecen, PO Box 400, H-4002, Debrecen, Hongrie

Attila Mandi & Tibor Kurtán

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Mark W. Ruszczycky et Hung-wen Liu

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Ming Ma

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Ghader Bashiri

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BCD, WZ, CY, HC, LP et WL ont effectué des réactions d'ouverture d'époxyde, d'isolement de composé et de détermination de structure. AM et TK ont effectué les calculs ECD. MM et GB ont fourni un composé clé et des réactifs. BCD, WZ, MWR, YZ, TK, HwL et CZ ont analysé les données et rédigé le manuscrit. CZ et HwL ont dirigé la recherche. BCD et WZ ont contribué à parts égales à ce travail.

Correspondance à Hung-wen Liu ou Changsheng Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Xudong Qu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

De, BC, Zhang, W., Yang, C. et al. Réactions d'ouverture de cycle époxydes réductrices et oxydatives activées par Flavin. Nat Commun 13, 4896 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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Reçu : 09 avril 2022

Accepté : 08 août 2022

Publié: 20 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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Communication Nature (2022)

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