Diminution de la sensibilité de Plasmodium falciparum à la fois à la dihydroartémisinine et à la luméfantrine dans le nord de l'Ouganda

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6353 (2022) Citer cet article

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La résistance partielle à l'artémisinine peut faciliter la sélection de Plasmodium falciparum résistant aux médicaments partenaires de la thérapie combinée. Nous avons évalué 99 isolats de P. falciparum collectés en 2021 dans le nord de l'Ouganda, où des mutations PfK13 C469Y et A675V associées à la résistance sont apparues, et dans l'est de l'Ouganda, où ces mutations sont rares. Avec le test de survie en anneau ex vivo, les isolats porteurs de la mutation 469Y (survie médiane de 7,3 % pour le mutant, 2,5 % mixte et 1,4 % de type sauvage) et/ou de mutations de la Pfcoronine ou de la falcipaïne-2a avaient une survie significativement supérieure ; tous les isolats avec une survie> 5% avaient des mutations dans au moins une de ces protéines. Avec les essais d'inhibition de la croissance ex vivo, la sensibilité à la luméfantrine (IC50 médiane 14,6 contre 6,9 nM, p < 0,0001) et à la dihydroartémisinine (2,3 contre 1,5 nM, p = 0,003) a diminué dans le nord par rapport à l'est de l'Ouganda ; 14/49 isolats du nord contre 0/38 isolats de l'est avaient une CI50 de luméfantrine > 20 nM (p = 0,0002). Le séquençage ciblé de 819 isolats de 2015 à 2021 a identifié plusieurs polymorphismes associés à une sensibilité altérée aux médicaments, notamment PfK13 469Y avec une sensibilité réduite à la luméfantrine (p = 6 × 10−8) et des mutations PfCRT avec résistance à la chloroquine (p = 1 × 10−20) . Nos résultats soulèvent des inquiétudes concernant l'activité de l'artéméther-luméfantrine, l'antipaludéen de première ligne en Ouganda.

La résistance aux médicaments a défié le traitement et le contrôle du paludisme à falciparum pendant des décennies1. Une résistance partielle aux artémisinines, les médicaments les plus importants actuellement utilisés pour traiter le paludisme, a été identifiée en Asie du Sud-Est il y a environ 15 ans2,3. Le phénotype de résistance partielle implique une clairance retardée des parasites après le traitement de patients avec des artémisinines4, ou une meilleure survie des parasites cultivés après exposition à la dihydroartémisinine (DHA)5. Il a été démontré qu'une résistance partielle en Asie du Sud-Est est associée à l'une des quelque 20 mutations candidates ou validées dans le domaine de l'hélice de la protéine P. falciparum kelch 13 (PfK13)6,7. Des polymorphismes supplémentaires ont accompagné des mutations de PfK13 chez des parasites d'Asie du Sud-Est résistants à l'artémisinine,8,9 et la sélection in vitro de parasites africains avec du DHA a entraîné une clairance retardée associée à des mutations de la coronine de P. falciparum (Pfcoronin)10. Des mutations de PfK13 validées comme médiateurs de la résistance en Asie du Sud-Est ont été signalées dans d'autres parties du monde11,12,13, mais jusqu'à récemment, les preuves d'une prévalence soutenue de ces mutations ou d'une résistance clinique ou in vitro documentée faisaient défaut14. La plus grande préoccupation a été l'émergence ou la propagation potentielle de la résistance en Afrique, où l'on observe l'essentiel de la morbidité et de la mortalité liées au paludisme15. Récemment, des mutations PfK13 précédemment liées à une résistance partielle à l'artémisinine en Asie ont été décrites en Afrique de l'Est, avec l'émergence de la mutation PfK13 R561H au Rwanda16,17,18 et des mutations C469Y et A675V dans le nord de l'Ouganda19,20,21,22. Dans des études limitées, il a été démontré que les mutations C469Y, R561H et A675V s'associent à une résistance partielle à l'artémisinine mesurée cliniquement (clairance retardée) ou in vitro (survie améliorée)17,22, mais notre compréhension des impacts de l'émergence récente de P. falciparum mutations sur la sensibilité aux médicaments et l'efficacité des traitements des principales combinaisons thérapeutiques à base d'artémisinine (ACT) en Afrique est incomplète.

Les CTA combinent une artémisinine à action rapide et un médicament partenaire à action plus lente23. En Asie du Sud-Est, l'émergence de la résistance partielle à l'artémisinine a été suivie de preuves d'une diminution de l'activité antipaludique des médicaments partenaires de l'ACT, la méfloquine24 et la pipéraquine25. Notamment, la résistance aux artémisinines, associée principalement à la mutation PfK13 580Y, et à la pipéraquine, associée à de nouvelles mutations dans PfCRT et à l'amplification du gène plasmepsine 2/3, a entraîné des taux d'échec pour la DHA-pipéraquine > 50 % au Cambodge26,27,28. L'émergence récente d'une résistance partielle aux artémisinines en Afrique de l'Est peut également conduire à la sélection de parasites présentant une sensibilité réduite aux médicaments partenaires ACT. Compte tenu du lourd tribut du paludisme en Afrique, cette conséquence pourrait être dévastatrice, comme on l'a vu avec l'émergence de la résistance à la chloroquine dans les années 1980, entraînant des millions de décès supplémentaires dus au paludisme29.

L'ACT le plus couramment utilisé pour traiter le paludisme en Afrique est l'artéméther-luméfantrine. Contrairement à la plupart des antipaludéens, la luméfantrine n'est pas disponible en monothérapie, mais uniquement en association avec l'artéméther. C'est peut-être pour cette raison que la résistance de P. falciparum à la luméfantrine n'a pas été définitivement identifiée chez les parasites isolés au champ. Cependant, un phénotype instable de résistance à la luméfantrine a été sélectionné par une incubation à long terme avec le médicament in vitro30, et des variations de sensibilité à la luméfantrine ont été observées dans des études d'isolats de terrain. La sensibilité à la luméfantrine a été associée à des polymorphismes dans PfMDR1, un transporteur de médicament putatif. La mutation PfMDR1 86Y a été sélectionnée par l'utilisation d'amodiaquine, contre-sélectionnée par une thérapie à l'artéméther-luméfantrine, et a diminué pour atteindre une très faible prévalence dans la majeure partie de l'Afrique15, y compris l'Ouganda20, ces dernières années. Le génotype sauvage PfMDR1 N86 est associé à une sensibilité ex vivo plus faible à la luméfantrine par rapport à celle des parasites mutants 86Y31,32, et a été associé à l'échec du traitement dans une analyse des données de 31 essais cliniques33, mais les changements de sensibilité associés à cet allèle étaient modestes . La sensibilité à la luméfantrine est également diminuée avec l'amplification du gène pfmdr134,35, mais ce polymorphisme a été très rare chez les parasites africains étudiés15. En Ouganda, la sensibilité à la luméfantrine a légèrement diminué en conjonction avec la perte de la mutation PfMDR1 86Y au fil du temps31,32,36,37, l'efficacité clinique relative de l'artéméther-luméfantrine par rapport à celle de l'artésunate-amodiaquine a diminué au fil du temps38, et un essai récent a montré une efficacité du traitement de l'artéméther-luméfantrine inférieure à 90 % sur un site39. Dans l'ensemble, bien que l'activité in vitro de la luméfantrine et l'efficacité clinique de l'artéméther-luméfantrine soient généralement restées bonnes, il existe des preuves que l'activité pourrait diminuer.

L'émergence récente de P. falciparum résistant à l'artémisinine dans le nord de l'Ouganda fait craindre que la résistance aux médicaments partenaires ACT puisse suivre, comme on le voit en Asie du Sud-Est. Pour explorer cette possibilité et mieux caractériser la résistance partielle à l'artémisinine en Ouganda, nous avons comparé les génotypes et les phénotypes de parasites collectés dans le nord de l'Ouganda, où les mutations PfK13 469Y et 675V sont apparues ces dernières années, et dans l'est de l'Ouganda, où nous avons étudié des isolats cliniques pendant plus de une décennie, et les marqueurs de résistance à l'artémisinine sont rares. En outre, nous avons analysé une plus grande banque d'isolats phénotypés de l'est de l'Ouganda afin de mieux explorer les corrélats génétiques des phénotypes de sensibilité aux médicaments.

Pour comparer les isolats de différentes parties du pays, nous avons évalué les génotypes, l'inhibition de la croissance et la survie en anneau pour les isolats prélevés chez des patients présentant un paludisme à falciparum non compliqué au Patongo Health Center III, Agogo District, dans le nord de l'Ouganda (n = 57), et Tororo Hôpital de district, district de Tororo et centre de santé de Busiu IV, district de Mbale, deux sites voisins dans l'est de l'Ouganda (n = 42), du 31 mai au 16 août 2021 (Fig. 1). Les caractéristiques des participants fournissant ces échantillons et les caractéristiques de leurs infections sont décrites dans le tableau 1. Dans une enquête plus large, nous avons évalué les génotypes et l'inhibition de la croissance pour les isolats de 819 patients présentant un paludisme à falciparum non compliqué, y compris les sites indiqués ci-dessus et l'hôpital Masafu, Busia District, du 9 décembre 2015 au 20 août 2021 (tableau 1). Les sensibilités aux médicaments pour les échantillons de l'est de l'Ouganda jusqu'en 2019 ont été publiées précédemment32 ; Dans ce rapport, nous nous concentrons sur les associations entre le séquençage approfondi des médiateurs de résistance potentiels et les phénotypes de sensibilité aux médicaments.

Les sites d'étude sont étiquetés. La prévalence combinée des mutations PfK13 469Y et 675V dans les districts pour lesquels des données de surveillance sont disponibles depuis 201921 est indiquée avec l'échelle de couleurs. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour les isolats collectés simultanément dans le nord et l'est de l'Ouganda en 2021, nous avons utilisé des tests de sonde d'inversion moléculaire (MIP) pour caractériser les séquences de 80 gènes potentiellement médiateurs de la résistance aux médicaments (tableau supplémentaire 1). Les polymorphismes parasitaires récemment associés à une sensibilité altérée aux composants des ACT, à savoir les mutations du domaine de l'hélice PfK13 associées à une résistance partielle aux artémisinines, et les polymorphismes associés à une sensibilité altérée à la luméfantrine (amplification et mutations pfmdr1) et à la pipéraquine (amplification plasmepsine 2/3) étaient particulièrement intéressants. et nouvelles mutations PfCRT). Conformément aux données récentes, les prévalences des mutations PfK13 C469Y et A675V étaient plus élevées dans le nord que dans l'est de l'Ouganda (C469Y 34 % contre 3 %, p < 0,001 ; A675V 13 % contre 3 %, p = 0,06, tableau 2) . Les autres mutations du domaine de l'hélice PfK13 étaient rares ; 15 mutations en amont du domaine de l'hélice ont été identifiées. Aucune amplification des gènes pfmdr1 ou plasmepsine 2/3 ni mutations PfCRT associées à la résistance à la pipéraquine en Asie (T93S, H97Y, F145I, I218F, M343L, G353V)40,41 n'ont été observées. Considérant d'autres polymorphismes bien décrits précédemment associés à la résistance aux médicaments, les prévalences de mutations dans les transporteurs PfCRT (K76T) et PfMDR1 (N86Y, D1246Y) associées à une sensibilité altérée aux aminoquinolines étaient très faibles, les prévalences de cinq mutations dans PfDHFR (N51I, C59R, S108N) et PfDHPS (A437G, K540E) associées à la résistance aux antifolates pyriméthamine et sulfadoxine étaient très élevées, et des mutations supplémentaires dans PfDHFR (I164L) et PfDHPS (A581G) associées à une résistance élevée aux antifolates ont été observées à de faibles prévalences, toutes conforme aux données récentes de l'Ouganda (tableau 2)20,21.

Sensibilités à la luméfantrine (test d'inhibition de la croissance A) et au DHA (B RSA) chez les parasites du nord et de l'est de l'Ouganda. Chaque point représente le résultat pour un seul isolat (A n = 49 pour le nord et 38 pour l'est de l'Ouganda ; B n = 52 pour le nord et 29 pour l'est de l'Ouganda). Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide du test bilatéral de Mann-Whitney Wilcoxon. Les limites centrales des cases correspondent à la médiane, et les limites minimales et maximales correspondent respectivement aux 25e et 75e centiles. Les moustaches s'étendent jusqu'à des valeurs extrêmes ne dépassant pas 1,5 fois l'IQR à partir du 25e ou du 75e centile. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour les isolats de 2021 étudiés avec le test de survie en anneau (RSA), les échantillons ont été stockés à 4 °C et transportés le jour de la collecte à notre laboratoire de Tororo. Le temps de stockage avant le début de la culture était légèrement plus long pour les échantillons prélevés dans le nord que dans l'est de l'Ouganda (médiane 25,0 h dans le nord vs 24,0 h dans l'est de l'Ouganda, p = 0,001). Les sensibilités à un panel de sept antipaludéens ont été étudiées avec un test standard d'inhibition de la croissance (IC50) et, pour le DHA, avec le RSA ex vivo. Des dosages de parasites collectés dans les deux régions du pays ont été menés en parallèle. Les sensibilités à la chloroquine, à la déséthylamodiaquine (le métabolite actif de l'amodiaquine), à la pipéraquine, à la méfloquine et à la pyronaridine étaient similaires entre les deux sites et, pour chacun de ces médicaments, les CI50 étaient à des niveaux généralement considérés comme hautement sensibles (tableau 3). En revanche, pour la luméfantrine et le DHA, les isolats du nord de l'Ouganda étaient significativement moins sensibles (après correction de Bonferroni) que ceux de l'est de l'Ouganda (luméfantrine IC50 14,6 contre 6,9 nM, p < 0,0001 ; dihydroartémisinine IC50 2,3 contre 1,5 nM, p = 0,003 ; Tableau 3). Pour la luméfantrine, 14 des 49 isolats du nord, mais aucun des 38 de l'est de l'Ouganda n'avait d'IC50> 20 nM (p = 0, 0002; Fig. 2). Les RSA, qui impliquaient de compter les parasites 72 h après le début d'une impulsion de DHA de 6 h, n'ont pas montré de différences significatives de survie entre les isolats du nord (médiane de survie de 2,5 % pour 52 échantillons) et de l'est (médiane de survie de 1,4 % pour 29 échantillons ; p = 0,53) en Ouganda, mais il convient de noter que certains parasites porteurs de mutations PfK13 associées à une clairance parasitaire retardée étaient présents sur les deux sites (Fig. 2).

Dans les 81 échantillons de 2021 avec des données RSA disponibles, nous avons recherché des associations entre la survie en anneau et les génotypes PfK13. Les isolats porteurs de la mutation PfK13 469Y avaient une survie significativement plus élevée, la survie étant la plus élevée pour les mutants purs (médiane de 7, 3%) par rapport aux parasites mixtes (2, 5%) et de type sauvage pur (1, 4%) (Fig. 3). La mutation PfK13 675 V n'était pas associée à une augmentation de la survie, mais cette analyse était limitée par la taille de l'échantillon, avec seulement 2 isolats purs mutants 675 V disponibles pour l'étude. Pour un examen plus large des déterminants potentiels de la résistance, nous avons utilisé les tests de Mann-Whitney Wilcoxon pour rechercher des associations entre les polymorphismes dans 23 gènes pour lesquels des variants ont été associés à une résistance partielle à l'artémisinine et nos résultats RSA (tableau supplémentaire 1). Les polymorphismes rares ont été évalués en tant que variables agrégées, comme décrit dans les méthodes. Les polymorphismes de cinq gènes étaient associés à une diminution ou à une augmentation de la survie des anneaux par rapport au type sauvage (tableau supplémentaire 2). Parmi ces gènes, en considérant l'allèle le plus répandu (allèle majeur) comme type sauvage et l'allèle mineur comme mutant, l'une des 8 mutations de Pfcoronin (survie 6,5 % chez le mutant contre 2,3 % chez le type sauvage, p = 0,04) ou l'une des 17 mutations de la falcipaïne 2a (survie de 3,2 % chez le mutant contre 0,6 % chez le type sauvage, p = 0,02) étaient les plus fortement associées à une augmentation de la survie de l'anneau, soit seules, soit en association avec des mutations de PfK13 (Fig. 4). Compte tenu des impacts combinés, la présence de PfK13 469Y plus toute mutation de Pfcoronine (survie médiane de 12,6 % chez le double mutant contre 1,4 % chez le double de type sauvage, p = 0,009) ou de falcipaïne-2a (survie médiane de 3,9 % chez le double mutant contre 0 % dans le type sauvage double, p = 0,004) était également associée à une survie accrue. Il convient de noter que bien que certains isolats avec une séquence PfK13 de type sauvage aient des niveaux élevés de survie en anneau, ces valeurs aberrantes semblaient être expliquées par des mutations dans la falcipaïne-2a ; tous les isolats avec une survie en anneau> 5% avaient soit la mutation PfK13 469Y, soit des mutations de la falcipaïne-2a, soit les deux. Fait intéressant, les mutations de PfK13 en dehors du domaine de l'hélice étaient associées à une diminution de la survie RSA (à l'opposé de l'effet de PfK13 469Y) ; compte tenu de l'une des 15 mutations non propulsives identifiées, la survie était de 1,5 % chez 42 mutants contre 5,5 % chez 26 isolats de type entièrement sauvage (p = 0,02; tableau supplémentaire 2). Deux autres polymorphismes avec des associations indépendantes significatives étaient la délétion dans une ubiquitine hydrolase carboxyl-terminale putative, associée à une survie accrue de RSA, et un SNP dans un gène codant pour une protéine de fonction inconnue, associée à une diminution de la survie.

Chaque point représente le résultat pour un seul isolat (A n = 50 WT, 18 C469Y, 6 A675V; B n = 50 WT, 8 C469Y, 10 469Y, 4 A675V, 2 675V). Les résultats sont présentés avec des isolats mutants mixtes et purs combinés (A) ou présentés séparément (B). Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide du test bilatéral de Mann-Whitney Wilcoxon. Les limites centrales des cases correspondent à la médiane, et les limites minimales et maximales correspondent respectivement aux 25e et 75e centiles. Les moustaches s'étendent jusqu'à des valeurs extrêmes ne dépassant pas 1,5 fois l'IQR à partir du 25e ou du 75e centile. WT, type sauvage. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les sensibilités au DHA par RSA chez les parasites avec différents génotypes PfK13, Pfcoronine (CRN; A, B) et falcipaïne-2a (FP2a; C, D) sont présentées. Chaque point représente le résultat pour un seul isolat (A n = 38 WT, 18 Mut ; B n = 26 C469 + CRN-WT, 9 C469 + CRN-Mut, 12 469Y + CRN-WT, 5 469Y + CRN-Mut ; C n = 17 WT, 47 Mut ; D n = 11 C469 + FP2a-WT, 30 C469 + FP2a-Mut, 3 469Y + FP2a -WT, 15 469Y + FP2a-Mut). Les génotypes PfK13 au codon 469 sont indiqués ; le mutant 469Y comprend des isolats mixtes. Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide du test bilatéral de Mann-Whitney Wilcoxon. Les bornes centrales des cases correspondent à la médiane, et les bornes minimales et maximales correspondent respectivement aux 25e et 75e centiles. Les moustaches s'étendent jusqu'à des valeurs extrêmes ne dépassant pas 1,5 fois l'IQR à partir du 25e ou du 75e centile. WT, type sauvage, Mut, tout polymorphisme Pfcoronine ou falcipaïne 2a. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En comparant les résultats des échantillons prélevés dans le nord et l'est de l'Ouganda en 2021, les isolats porteurs de la mutation PfK13 469Y ou 675 V étaient significativement moins sensibles à la luméfantrine (IC50 14,1 nM pour 469Y mixte ou mutant, 14,7 nM pour 675 V mixte ou mutant et 8,7 nM pour le type sauvage ; Fig. 5). Les sensibilités aux autres médicaments testés, y compris la méfloquine, qui semble partager certains déterminants de la diminution de l'activité avec la luméfantrine15, ne différaient pas entre les parasites de type sauvage et les mutants PfK13.

Chaque point représente le résultat pour un seul isolat (A n = 61 WT, 17 C469Y, 6 A675V; B n = 61 WT, 7 C469Y, 10 469Y, 5 A675V, 1 675V). Les résultats sont présentés avec des isolats mutants mixtes et purs combinés (A) ou présentés séparément (B). Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide du test bilatéral de Mann-Whitney Wilcoxon. Les bornes centrales des cases correspondent à la médiane, et les bornes minimales et maximales correspondent respectivement aux 25e et 75e centiles. Les moustaches s'étendent jusqu'à des valeurs extrêmes ne dépassant pas 1,5 fois l'IQR à partir du 25e ou du 75e centile. WT, type sauvage. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour examiner plus largement les associations entre phénotypes et génotypes, nous avons utilisé un grand ensemble de 819 isolats avec des données d'inhibition de la croissance, collectés principalement dans l'est de l'Ouganda de 2015 à 2021, et comprenant également 49 échantillons collectés dans le nord de l'Ouganda en 2021, comme décrit ci-dessus. L'ADN parasitaire a été génotypé à l'aide de la plateforme MIP ciblant 80 gènes codant pour des protéines potentiellement associées à la sensibilité aux médicaments, y compris des protéines connues ou supposées être des transporteurs de médicaments et des protéines pour lesquelles des polymorphismes sont connus ou suspectés de contribuer à la résistance aux antipaludiques établis et aux composés en cours de développement (Supplémentaire Tableau 1). Nous avons identifié un total de 4337 polymorphismes et utilisé les tests de Mann–Whitney Wilcoxon pour explorer les relations entre la variation des CI50 ex vivo et la présence de ces polymorphismes.

Nous nous sommes d'abord concentrés sur la luméfantrine, en raison de l'identification de différences significatives de sensibilité dans les échantillons du nord et de l'est de l'Ouganda, comme décrit ci-dessus. Lors de l'évaluation de 713 isolats, nous avons identifié 33 polymorphismes non synonymes associés à la CI50 de la luméfantrine, avec une signification à p ≤ 0,01. Nous avons ensuite filtré pour inclure uniquement les locus où les IC50 médianes des allèles mixtes et mutants avaient tendance dans la même direction (les deux avaient une sensibilité accrue ou réduite aux médicaments par rapport aux parasites avec des génotypes purs de type sauvage) et pour lesquels l'allèle minoritaire pur était présent dans au moins un goûter. Cela a abouti à l'identification de polymorphismes dans 9 gènes associés à une sensibilité altérée à la luméfantrine (tableau 4). Plus particulièrement, les mutations PfK13 apparues dans le nord de l'Ouganda étaient fortement associées à une diminution de la sensibilité à la luméfantrine (469Y, p = 6 × 10−8 ; 675 V p = 0,001). D'autres associations, avec une sensibilité accrue ou réduite à la luméfantrine, comprenaient des SNP dans PfMDR1, y compris la mutation 86Y qui est maintenant très rare, mais qui était auparavant associée à une sensibilité accrue à la luméfantrine ; et des polymorphismes dans une phospholipase putative ; le facteur de transcription ApiAP2 ; les protéines multirésistantes PfMRP1 et PfMRP2 ; et les hémoglobinases falcipaïne-2a, falcipaïne-3 et plasmepsine I (tableau 4).

En considérant les six autres médicaments testés, en appliquant les mêmes critères de filtrage que pour la luméfantrine, des associations entre une variété de polymorphismes et la sensibilité aux médicaments ont été identifiées, principalement à des niveaux de signification relativement faibles (tableaux supplémentaires 3 à 8). Plus frappant encore, il y avait une forte association entre des mutations bien caractérisées dans PfCRT, y compris la mutation K76T connue pour médier la résistance à la chloroquine, et la sensibilité à la chloroquine (p = 10−7−10−20 pour 6 mutations PfCRT) et le médicament apparenté monodéséthylamodiaquine (p = 0,01–0,0003 pour 4 mutations PfCRT). Ces résultats étaient attendus15, et ils soutiennent la validité globale de nos analyses.

De manière anecdotique, certains phénotypes remarquables de sensibilité aux médicaments ex vivo se sont révélés instables, avec des CI50 pour les médicaments antipaludiques plus faibles après l'adaptation de la culture par rapport aux valeurs observées immédiatement après le prélèvement de l'échantillon, ce qui pourrait s'expliquer par une croissance plus réussie des souches sensibles aux médicaments par rapport aux souches résistantes aux médicaments dans des cultures mixtes . Pour explorer la stabilité des phénotypes observés, nous avons adapté à la culture des souches du nord de l'Ouganda avec des résultats remarquables d'IC50 pour la luméfantrine. La sensibilité à la luméfantrine était généralement plus élevée chez les parasites adaptés à la culture par rapport aux valeurs ex vivo initiales. Pour huit isolats avec des valeurs originales de CI50 ex vivo de la luméfantrine > 30 nM (CI50 médiane 39,5 nM), les valeurs de CI50 suivantes mesurées après culture pendant 4 semaines ou plus, puis après congélation, décongélation, croissance en culture et essais répétés, étaient généralement inférieures à les valeurs initiales ex vivo (tableau 5). Cependant, après adaptation à la culture, les valeurs de CI50 pour ces huit isolats du nord de l'Ouganda mesurées avant (CI50 médiane 13,2 nM) ou après (CI50 médiane 16,9 nM évaluée en Ouganda et 7,4 nM évaluée aux États-Unis) congélation-décongélation-reculture étaient supérieures aux valeurs des parasites collectés de l'est de l'Ouganda pour une comparaison directe avec les isolats du nord de l'Ouganda (IC50 médiane 6,9 nM pour 38 isolats) ou pour un plus grand ensemble d'isolats publiés précédemment (IC50 médiane 5,1 nM pour 365 isolats32).

L'émergence dans le nord de l'Ouganda de P. falciparum hébergeant les mutations PfK13 C469Y ou A675V soulève des inquiétudes concernant la sélection de parasites résistants à la fois aux artémisinines et aux médicaments partenaires ACT, ce qui pourrait conduire à l'incapacité des ACT de première ligne à traiter efficacement le paludisme. Pour mieux apprécier la situation actuelle, nous avons directement comparé les sensibilités aux médicaments des isolats collectés en 2021 auprès de patients atteints de paludisme dans le nord de l'Ouganda, où les mutations PfK13 ont été courantes ces dernières années, et dans l'est de l'Ouganda, où elles ont été rares. Nous avons trouvé, comme prévu, une prévalence élevée des mutations C469Y et A675V dans les isolats du nord de l'Ouganda, bien que la prévalence soit également plus élevée que celle observée précédemment dans les isolats de l'est de l'Ouganda21. En utilisant le DHA RSA, la mesure standard de la sensibilité in vitro aux artémisinines, nous avons observé une association entre la mutation C469Y, mais pas la mutation A675V (pour laquelle peu d'échantillons étaient disponibles pour l'étude), et une diminution de la survie du parasite. En utilisant des tests d'inhibition de croissance standard, la sensibilité à la luméfantrine et au DHA, mais pas aux autres médicaments testés, était significativement plus faible dans les isolats du nord, par rapport à l'est de l'Ouganda. Compte tenu d'un nombre beaucoup plus important d'isolats collectés entre 2015 et 2021, mais pour lesquels seuls des tests d'inhibition de la croissance étaient disponibles, une diminution de la sensibilité à la luméfantrine était fortement associée à la mutation PfK13 469Y. Ces résultats suggèrent que l'émergence d'une résistance partielle aux artémisinines s'est accompagnée d'une diminution de l'activité de la luméfantrine, présageant potentiellement une perte d'efficacité de l'artéméther-luméfantrine, l'antipaludéen de première intention en Ouganda et dans la majeure partie de l'Afrique.

Il est important de déterminer si les mutations PfK13 récemment identifiées dans le nord de l'Ouganda19,20,21,22 sont associées à une survie accrue du parasite après exposition aux artémisinines. Des travaux antérieurs ont identifié une association entre la mutation 675V et la clairance clinique retardée après un traitement aux artémisinines en Asie du Sud-Est7. Dans une étude récente du nord de l'Ouganda, les deux mutations étaient associées à une clairance clinique retardée et seule la mutation 675V avec une survie accrue ex vivo après exposition au DHA, mais les analyses étaient limitées par relativement peu d'isolats mutants pour l'étude22. Une étude du Rwanda a montré que des isolats uniques collectés en 2019 avec les mutations 469 F, 561H et 675 V avaient une survie accrue in vitro par rapport à un parasite de type sauvage18, mais à notre connaissance, la mutation 469Y n'avait pas été associée auparavant à une survie accrue dans un RSA. Dans nos études, la mutation 469Y était significativement associée à une meilleure survie par RSA. Par conséquent, nos résultats renforcent la conclusion selon laquelle les deux mutations PfK13 apparues récemment dans le nord de l'Ouganda sont associées à une résistance partielle à l'artémisinine.

Il a été démontré que des polymorphismes dans un certain nombre de protéines de P. falciparum sont associés à une résistance partielle à l'artémisinine, soit en conjonction avec des mutations PfK13, soit indépendamment8,10, mais des médiateurs cohérents autres que PfK13 n'ont pas été identifiés, et la médiation de la résistance semble être fortement dépend du fond génétique du parasite42. Notre évaluation des associations entre les polymorphismes dans 23 gènes candidats et la survie améliorée dans le RSA a identifié un certain nombre de polymorphismes avec une association modeste avec une survie améliorée (tableau supplémentaire 2), et l'association la plus forte avec des polymorphismes dans deux gènes, codant pour la falcipaïne-2a et la Pfcoronine.

De manière frappante, tous les isolats avec une survie RSA> 5% malgré l'absence de la mutation PfK13 469Y présentaient des mutations dans la falcipaïne-2a. Sur les 17 mutations identifiées dans la falcipaïne-2a, 11 ont également été identifiées dans des isolats d'Asie du Sud-Est dans lesquels les haplotypes de la falcipaïne-2a étaient associés à une meilleure survie RSA9. La falcipaïne-2a est une hémoglobinase qui joue un rôle clé, de concert avec d'autres protéases, dans l'hydrolyse de l'hémoglobine pour fournir des acides aminés pour le métabolisme du parasite43. La perte d'activité de la falcipaïne due au traitement avec des inhibiteurs spécifiques ou à l'inactivation du gène a nettement émoussé l'activité antipaludique du DHA, indiquant que la protéolyse de l'hémoglobine médiée par la falcipaïne est nécessaire pour une activation efficace des artémisinines44. Ces résultats sont cohérents avec notre compréhension que la conversion des artémisinines par l'hème, après libération de l'hémoglobine, en radicaux libres toxiques, est une condition préalable à l'action efficace des artémisinines45. Fait intéressant, une mutation codant pour un codon stop de la falcipaïne-2a a été identifiée chez des parasites sélectionnés in vitro pour leur résistance à l'artémisinine, mais cette sélection s'est produite après l'émergence d'une mutation PfK136. Dans l'ensemble, les données disponibles suggèrent que certaines mutations de la falcipaïne-2a peuvent induire une résistance partielle à l'artémisinine indépendamment ou de concert avec des mutations de PfK13.

Dans les études sur les parasites du Sénégal, la sélection in vitro de P. falciparum avec des concentrations croissantes de DHA a sélectionné des parasites à survie améliorée associée à des mutations de Pfcoronin, mais pas de PfK1310 ; les impacts des mutations de la Pfcoronine sur la survie après une exposition au DHA variaient en fonction du patrimoine génétique du parasite46. La pfcoronine est un membre de la famille des protéines du domaine propulseur WD40 qui est connue pour s'associer aux filaments d'actine et aux membranes intracellulaires47,48. La base biologique des contributions des mutations de la Pfcoronine à la résistance partielle à l'artémisinine est inconnue, mais il a été noté que les impacts des mutations de la Pfcoronine sont masqués par les mutations de PfK13, ce qui suggère que les mutations dans les deux protéines peuvent avoir un impact sur les mêmes mécanismes parasitaires46.

Des polymorphismes supplémentaires ont été associés à une survie RSA altérée. Une délétion dans pfubp1, qui code pour une enzyme de déubiquitination putative, a été associée à une survie accrue de l'anneau. Deux mutations de l'homologue P. chabaudi de cette protéine ont été associées à la résistance à l'artémisinine dans un croisement génétique murin49 ; les mutations étaient liées à la résistance partielle à l'artémisinine chez P. falciparum in vitro50 et P. berghei chez la souris51, mais pas à la résistance partielle clinique52 ; et la protéine s'est avérée par marquage d'affinité s'associer à PfK1353. Nos résultats appuient ces données limitées identifiant les mutations PfUBP1 en tant que médiateurs secondaires potentiels de la résistance partielle à l'artémisinine. Fait intéressant, la présence de l'une des 15 mutations PfK13 du domaine pré-propeller était associée à une diminution de la survie. Ces résultats suggèrent que, peut-être paradoxalement, ces mutations renforcent l'activité de l'artémisinine, l'effet inverse des mutations du domaine propulseur. Un polymorphisme dans une protéine de fonction inconnue (Pf3D7_1433800) a également été associé à une survie accrue. Un polymorphisme différent dans cette protéine a été sélectionné dans les mêmes expériences qui ont identifié la Pfcoronine comme un déterminant potentiel de la résistance10, mais cela n'a pas semblé contribuer à l'augmentation de la survie de l'anneau46.

Nous avons également comparé la sensibilité des isolats de P. falciparum à un panel de sept antipaludiques en utilisant un test d'inhibition de croissance standard. En considérant uniquement les isolats collectés et étudiés au cours de la même période en 2021, les sensibilités à deux médicaments, la luméfantrine et le DHA, étaient plus faibles dans les isolats du nord de l'Ouganda que ceux de l'est de l'Ouganda. Si l'on considère un ensemble beaucoup plus important d'isolats collectés en 2015-2021, les polymorphismes de neuf gènes étaient associés à une sensibilité altérée à la luméfantrine par rapport à celle des parasites de type sauvage. Ces résultats mettent en évidence des médiateurs potentiels ou des facteurs associés à une sensibilité altérée à la luméfantrine. Premièrement, les mutations PfK13 469Y et 675 V étaient fortement associées à une diminution de la sensibilité, soulignant le potentiel d'une résistance partielle aux artémisinines associée à une diminution de la sensibilité aux médicaments partenaires. Cependant, ces résultats n'indiquent pas un rôle causal des mutations PfK13 dans la sensibilité altérée à la luméfantrine. Deuxièmement, trois mutations du transporteur de médicament putatif PfMDR1 étaient associées à une sensibilité altérée à la luméfantrine ; l'un d'entre eux, 86Y, était auparavant à forte prévalence en Afrique, a été sélectionné par l'exposition à la luméfantrine15 et a été associé à une sensibilité accrue aux médicaments dans des études antérieures31,32 et notre analyse actuelle. Troisièmement, des mutations dans une phospholipase putative étaient associées à une sensibilité altérée à la luméfantrine. Les mutations de cette protéine ont été précédemment sélectionnées par une exposition in vitro à la primaquine et associées à une diminution de la sensibilité à ce médicament54. Fait intéressant, les mutations de perte de fonction dans une autre phospholipase de P. falciparum prédite, PfPARE, étaient associées à une diminution de la sensibilité au MMV011438, à une série d'esters de pepstatine55 et au candidat antipaludéen oxoborole AN1376256, probablement en raison de la perte d'activation intracellulaire du médicament. Quatrièmement, différents polymorphismes dans un facteur de transcription prédit de P. falciparum, ApiAP257, ont été associés à la fois à une sensibilité accrue et diminuée à la luméfantrine. Différentes mutations de cette protéine ont été associées à une diminution de la sensibilité à trois composés différents en cours de développement comme antipaludéens dans un dépistage chimiogénétique54 et à la quinine dans une étude d'association à l'échelle du génome58. Cinquièmement, des mutations dans les transporteurs de médicaments putatifs PfMRP1 et PfMRP2 étaient associées à des altérations de la sensibilité à la luméfantrine. D'autres mutations de PfMRP1 ont été décrites chez des parasites africains et associées à un traitement antérieur par l'artéméther-luméfantrine59 et à une diminution de la sensibilité à la chloroquine, à l'artémisinine, à la méfloquine, à la luméfantrine, à la pipéraquine et/ou au DHA dans différentes études60,61,62,63. Une délétion dans le promoteur en amont de PfMRP264 et un certain nombre de polymorphismes dans la séquence codante65 ont été associés à une diminution de la sensibilité aux aminoquinolines. Sixièmement, les SNP dans les gènes codant pour les hémoglobinases, les protéases à cystéine falcipaïne-2a et falcipaïne-343 et la protéase aspartique plasmepsine-I66, ont été associés à une activité luméfantrine altérée. Comme indiqué ci-dessus, une diminution de l'activité de la falcipaïne-2a par inhibition enzymatique ou inactivation de gène a entraîné une diminution de la sensibilité aux artémisinines44, et une altération de la fonction d'autres hémoglobinases pourrait également avoir un impact sur l'action de l'artémisinine.

L'identification de parasites avec des CI50 de luméfantrine inhabituellement élevées dans le nord de l'Ouganda a conduit à s'intéresser à la caractérisation de ce phénotype. Cependant, le phénotype s'est avéré instable. La croissance des parasites en culture pendant 4 semaines ou plus pour établir des parasites adaptés à la culture s'est accompagnée d'une augmentation de la sensibilité à la luméfantrine. Ainsi, il semble que certains parasites présentant une sensibilité réduite à la luméfantrine circulent dans le nord de l'Ouganda, mais que, dans les isolats mixtes généralement présents dans cette région, les souches les moins sensibles sont régulièrement supplantées par des souches plus sensibles aux médicaments pendant la culture, et/ou les phénotypes de sensibilité réduite sont perdus in vitro en raison de différences environnementales inexpliquées entre la croissance in vivo et in vitro des parasites.

Notre étude comportait des limites importantes. Premièrement, en raison des défis logistiques liés à l'étude des isolats du district d'Agago dans notre laboratoire du district de Tororo (à environ 400 km de distance), nous avons collecté des parasites pour les RSA uniquement sur une période de 2 mois, limitant notre analyse à 57 isolats du nord de l'Ouganda. Deuxièmement, en raison de notre intérêt à étudier les isolats collectés au cours du même intervalle de temps, nous nous sommes limités à l'analyse des RSA pour 42 isolats de l'est de l'Ouganda. La taille limitée de l'échantillon a limité la puissance de nos analyses RSA. Troisièmement, les participants qui ont fourni des échantillons du nord et de l'est de l'Ouganda différaient à certains égards, notamment un âge inférieur et une parasitémie plus élevée chez ceux de l'est de l'Ouganda ; cependant, on ne s'attend pas à ce que ces différences aient un impact sur les mesures ex vivo de la sensibilité aux médicaments. Quatrièmement, les isolats étaient généralement polyclonaux, comme c'est généralement le cas pour les infections dans les régions à forte transmission d'Afrique. Les IC50 ex vivo représentaient nécessairement des moyennes d'activités de clones dans un échantillon, et les analyses génomiques peuvent avoir manqué certaines séquences de clones minoritaires. Cinquièmement, notre approche de séquençage profond multiplex a limité l'analyse de portions de certains gènes en raison d'un pavage incomplet ou de conditions de PCR insuffisamment équilibrées. Sixièmement, nos études étaient limitées aux gènes cibles et incapables de caractériser le complément complet de variation à travers le génome en relation avec la sensibilité aux médicaments ; des études supplémentaires, y compris des études d'association à l'échelle du génome et des croisements génétiques, seront utiles à cet égard. Malgré ces limitations, nous pensons que les associations robustes identifiées sont valides, mais une étude supplémentaire d'un plus grand nombre d'isolats collectés sur une large gamme géographique est certainement une priorité élevée.

Les ramifications cliniques de la diminution de l'activité des artémisinines et de la luméfantrine contre P. falciparum circulant dans le nord de l'Ouganda sont inconnues. La clairance des parasites porteurs des mutations PfK13 469Y et 675 V a été retardée, par rapport à celle des parasites de type sauvage, après traitement par l'artésunate intraveineux22. Ce résultat suggère que les réponses au traitement du paludisme grave causé par des parasites mutants peuvent être lentes, entraînant une augmentation de la morbidité et de la mortalité graves. Au Rwanda, la clairance des parasites avec une mutation PfK13 différente, 561H, a été retardée par rapport à celle des parasites de type sauvage, après un traitement à l'artéméther-luméfantrine, mais l'efficacité du traitement évaluée par des mesures standard ne différait pas entre les patients infectés par des parasites mutants et de type sauvage17 . Les impacts des mutations ougandaises 469Y et 675 V sur l'efficacité du traitement des ACT sont inconnus. Cependant, des réponses altérées à la fois aux artémisinines et à la luméfantrine, comme le suggèrent nos données, semblent susceptibles d'affecter les réponses au traitement par l'artéméther-luméfantrine, l'antipaludéen de première ligne en Ouganda et dans la plupart des pays d'endémie palustre en Afrique. Les études dans les régions avec des parasites mutants PfK13 de l'efficacité antipaludique de l'artésunate intraveineux pour traiter le paludisme grave et de l'artéméther-luméfantrine pour traiter le paludisme simple sont donc de la plus haute priorité.

Pour les évaluations qui comprenaient des RSA et des tests d'inhibition de la croissance, des échantillons ont été obtenus du 31 mai au 17 août 2021 sur 3 sites : Patongo Health Center III, Agogo District, dans le nord de l'Ouganda ; Hôpital du district de Tororo, district de Tororo, dans l'est de l'Ouganda ; et Busiu Health Center IV, district de Mbale, également dans l'est de l'Ouganda (Fig. 1). Pour les évaluations qui ne comprenaient que des tests d'inhibition de la croissance, des échantillons ont été obtenus de décembre 2015 à août 2021 sur les sites de l'est de l'Ouganda indiqués ci-dessus, ainsi que de l'hôpital de Masafu, dans le district de Busia, également dans l'est de l'Ouganda, comme décrit précédemment32. Pour le centre de santé de Patongo, les échantillons ont été prélevés deux fois par semaine et transportés le jour du prélèvement vers notre laboratoire à Tororo. Des échantillons provenant de sites de l'est de l'Ouganda ont été prélevés chaque jour selon leur disponibilité. Des isolats ont été prélevés chez des patients âgés de 6 mois ou plus présentant sur les sites des symptômes cliniques de paludisme, un frottis sanguin coloré au Giemsa positif pour P. falciparum et aucun signe de maladie grave. Les patients déclarant avoir utilisé un traitement antipaludique au cours des 30 jours précédents ou présentant des signes d'infection par d'autres espèces de Plasmodium ont été exclus. Le consentement écrit fut obtenu de tous les participants. Les parents ou tuteurs d'enfants de moins de 18 ans ont fourni un consentement écrit en leur nom ; les enfants âgés de 8 à 17 ans ont donné leur consentement. 2 à 5 ml de sang veineux ont été prélevés dans un tube à héparine avant le début du traitement. Les participants ont reçu de l'artéméther-luméfantrine, conformément aux directives nationales, après le prélèvement de l'échantillon. Les études ont été approuvées par le comité de recherche et d'éthique de l'Université Makerere, le Conseil national ougandais pour la science et la technologie et le comité de recherche humaine de l'Université de Californie à San Francisco.

La parasitémie a été identifiée avec des films minces colorés au Giemsa à l'aide d'un microscope optique avec un objectif 100 × et en comptant 1000 érythrocytes ou plus. En raison de considérations logistiques (échantillons prélevés à différents moments de la journée et à différents endroits), les échantillons ont été stockés à 4 ° C, la culture étant généralement lancée le matin après le prélèvement des échantillons. Les parasites ont été mis en culture comme décrit précédemment32. Le sang a été centrifugé pendant 10 min à température ambiante, le plasma et la couche leucocytaire ont été retirés et le culot d'érythrocytes a été lavé trois fois avec du milieu RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) à 37 ° C. Le culot a été remis en suspension dans un milieu complet composé de RPMI 1640 avec 25 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM hypoxanthine, 10 μg/mL gentamicine et 0,5 % AlbuMAX II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour produire un hématocrite de 50 %. De plus, 4 aliquotes des pastilles lavées d'environ 10 μL ont été déposées sur du papier filtre Whatman 3MM (Cytivia, Marlborough, MA, USA) pour une analyse moléculaire ultérieure.

Les sensibilités aux médicaments ont été évaluées dans des échantillons présentant un minimum de 0,3 % de parasitémie à l'aide d'un test d'inhibition de la croissance sur microplaque de 72 h avec détection du SYBR Green, comme décrit précédemment32. Les composés à l'étude (chloroquine, monodéséthylamodiaquine, pipéraquine, luméfantrine, méfloquine, dihydroartémisinine et pyronaridine), fournis par Medicines for Malaria Venture, ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (à l'exception de l'eau distillée pour la chloroquine) sous forme de stocks de 10 mM et stockés à -20 ° C. Les médicaments ont été dilués en série par un facteur de 3 dans du milieu complet dans des microplaques à 96 puits (50 μL par puits), y compris des puits témoins sans médicament et sans parasite, avec des concentrations optimisées pour capturer les courbes dose-réponse complètes. Les cultures ont été diluées avec des érythrocytes non infectés provenant de banques de sang locales pour des volumes totaux de 200 μL par puits à 0,2 % de parasitémie et 2 % d'hématocrite. Les plaques ont été maintenues à 5 % de CO2, 5 % d'O2 et 90 % de N2 pendant 72 h à 37 °C dans un incubateur modulaire humidifié (Billups Rothenberg, San Diego, CA, USA). Après 72 h, le contenu des puits a été remis en suspension et 100 μL de culture par puits ont été transférés dans des plaques noires à 96 puits contenant 100 μL par puits de tampon de lyse SYBR Green (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,008 % saponine, 0,08 % Triton X-100 , et 0,2 μL/mL SYBR Green I (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)), et mélangés. Les plaques ont été incubées pendant 1 h dans l'obscurité à température ambiante, puis la fluorescence a été mesurée avec un lecteur de plaques FLUOstar Omega (BMG LabTech, Cary, NC, USA ; excitation à 485 nm et émission à 530 nm). Pour surveiller la stabilité des stocks de médicaments, des souches de contrôle de laboratoire P. falciparum Dd2 (MRA-156) et 3D7 (MRA-102) (BEI Resources, Manassas, VA, USA) ont été maintenues en culture et dosées (en commençant au stade de l'anneau) environ mensuellement, après synchronisation avec une colonne magnétique (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA). Pour l'adaptation des parasites à la culture à long terme, les isolats fraîchement collectés ont été dilués à 1% de parasitémie, si nécessaire, en utilisant des érythrocytes donneurs et cultivés à 2% d'hématocrite dans du milieu complet RPMI dans les conditions décrites ci-dessus. Les cultures ont été diluées avec des érythrocytes non infectés selon les besoins. Après environ 4 semaines, les parasites au stade anneau ont été cryoconservés dans une solution de glycérolyte-57 (Frensenius Kabi AG, Hambourg, Allemagne) et stockés dans de l'azote liquide en phase gazeuse.

Les tests d'inhibition de croissance standard ne prédisent pas la clairance clinique retardée associée aux parasites résistants à l'artémisinine. Par conséquent, la sensibilité au DHA a été mesurée à l'aide du RSA ex vivo, comme décrit précédemment67. En bref, des parasites fraîchement cultivés avec un minimum de 0, 2% de parasitémie, préparés comme décrit ci-dessus pour les tests d'inhibition de la croissance, ont été incubés avec 700 nM de DHA ou, pour les témoins, 0, 1% de DMSO, pendant 6 h. Les isolats avec > 1 % de parasitémie ont été dilués à 1 % ; les isolats avec ≤ 1 % de parasitémie ont été cultivés au début des parasitémies. Les cellules ont été lavées pour éliminer le médicament après 6 h, et la culture a été poursuivie pendant 66 h supplémentaires. 72 h après le début de la culture, des frottis minces colorés au Giemsa ont été préparés. Les cultures ont été considérées comme viables et appropriées pour l'évaluation si la parasitémie témoin était ≥ 0,2 % et également ≥ 25 % de la parasitémie de départ. Les parasitémies ont été comptées dans les cultures témoins et traitées, et la survie RSA a été exprimée comme la proportion de parasites viables dans les cultures traitées au DHA par rapport aux témoins.

Les séquences de gènes et le nombre de copies ont été analysés par capture MIP et séquençage en profondeur, comme décrit précédemment21,32,68. Pour la capture de MIP, nous avons ciblé un total de 80 gènes, sélectionnés en raison de leurs rôles connus ou potentiels dans la modification de la sensibilité aux antipaludéens standard ou aux composés en cours de développement (tableau supplémentaire 1), en utilisant des sondes précédemment publiées et nouvellement conçues (tableau supplémentaire 9). De nouvelles sondes ont été conçues à l'aide du logiciel MIPTools (version 0.19.12.13). L'ADN a été isolé avec un tampon d'extraction Chelex-100 comme indiqué précédemment, en utilisant 0,01% de Tween 20 au lieu de saponine21. La capture MIP, la préparation de la bibliothèque et le séquençage ont été effectués comme décrit précédemment68. Les lectures de séquençage sont disponibles dans les archives de lecture de séquences du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (numéro d'accès PRJNA850445). MIPTools a été utilisé pour organiser les données de séquençage brutes et pour effectuer l'appel de variantes. Des génotypes individuels ont été attribués pour les sites polymorphes couverts par un minimum de 10 identificateurs moléculaires uniques (UMI) et les variants devaient avoir un nombre d'allèles dans l'échantillon ≥ 3 UMI pour les allèles alternatifs et ≥ 2 UMI pour les allèles de référence. Le nombre de copies a été estimé sur la base de la profondeur normalisée de l'échantillon et de la sonde de couverture de séquence à partir de 31 sondes uniques pour pfmdr1 et 21 sondes pour la plasmepsine 2/3. La souche Dd2, qui contient pfmdr1 amplifié et est une copie unique pour la plasmepsine 2/3, et le sous-clone G8 de KH001_053 (aimablement fourni par Selina Bopp et la collaboration TRAC), qui a plusieurs copies de la plasmepsine 269, ont été utilisés comme témoins. La complexité de l'infection (COI) a été estimée à partir des données de génotypage générées par séquençage MIP à l'aide de THE REAL McCOIL, un modèle Monte Carlo à chaîne de Markov qui estime la fréquence des allèles et le COI des échantillons70.

Les valeurs IC50 ont été dérivées en traçant l'intensité de la fluorescence par rapport à la concentration logarithmique du médicament et ajustées à une courbe non linéaire à l'aide d'une équation de Hill à quatre paramètres dans Prism (version 9.0), comme décrit précédemment32. Toutes les analyses supplémentaires ont été effectuées dans R (version 4.1.2). Les données catégorielles ont été évaluées à l'aide de tests exacts de Fisher bilatéraux et de données continues, y compris des tests d'inhibition de la croissance et des RSA, avec des tests bilatéraux de Mann-Whitney Wilcoxon. Pour l'évaluation des données IC50, les génotypes ont été considérés comme des variables binaires, déterminées par la présence ou l'absence de l'allèle mineur (les génotypes allèles mineurs mixtes et purs ont été combinés). P ≤ 0,01 ont été considérés comme significatifs. Pour la survie RSA, les loci avec une prévalence élevée (> 15 %) d'allèles mineurs ont été évalués indépendamment, comme décrit ci-dessus, et les loci avec une faible prévalence d'allèles mineurs (≤ 15 %) ont été analysés en tant que variables agrégées, dans lesquelles la présence de tout allèle mineur a été comparé à l'allèle majeur. Pour les locus à prévalence élevée et faible, p ≤ 0,05 ont été considérés comme significatifs. Pour les locus statistiquement significatifs, la survie RSA a également été évaluée dans le contexte des mutations K13 C469Y et A675V. Les loci candidats et les génotypes K13 ont été traités comme des variables binaires comme décrit ci-dessus.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données pertinentes sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. Les données de séquence sont disponibles dans les archives de lecture de séquence du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (numéro d'accès PRJNA850445). Les données et le code sont disponibles sur https://github.com/PJRosenthalLab/2022_Tumwebaze_NatCom. Les données sources sont fournies avec ce document.

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L'étude a été financée par les National Institutes of Health (AI075045 (PJR), AI089674 (PJR), TW007375 (PJR) et AI139520 (JAB)) et le Medicines for Malaria Venture (RD/15/0001 (PJR)). Nous remercions les participants à l'étude et les membres du personnel des cliniques où les échantillons ont été prélevés. Nous remercions Selina Bopp, Sarah Volkman et les membres de la collaboration TRAC pour avoir aimablement fourni un clone KH001_053 comme contrôle du nombre de copies.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Patrick K. Tumwebaze, Melissa D. Conrad.

Collaboration de recherche sur les maladies infectieuses, Kampala, Ouganda

Patrick K. Tumwebaze, Stephen Okitwi, Stephen Orena, Oswald Byaruhanga, Thomas Katairo et Samuel L. Nsobya

Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Melissa D. Conrad, Jennifer Legac, Shreeya Garg et Philip J. Rosenthal

Université Brown, Providence, RI, États-Unis

David Giesbrecht, Sawyer R. Smith et Jeffrey A. Bailey

Université dominicaine de Californie, San Rafael, Californie, États-Unis

Frida G. Ceja et Roland A. Cooper

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Tous les auteurs ont conçu et conçu les expériences ; PKT, MDC, MO, SO, OB, TK, JL, SG, DG, SRS, FGC et RAC ont acquis les données ; PKT, MDC, MO, SO, TK, SG, DG, JAB, RAC et PJR ont analysé et interprété les données ; PKT, MDC, SLN, JAB, RAC et PJR ont joué un rôle primordial dans la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Melissa D. Conrad ou Philip J. Rosenthal.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Colin Sutherland, Didier Ménard, Dulcie Lautu-Gumal et les autres relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Merci , PK , Conrad , MD , Okitwi , M et al. Diminution de la sensibilité de Plasmodium falciparum à la fois à la dihydroartémisinine et à la luméfantrine dans le nord de l'Ouganda. Nat Commun 13, 6353 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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Reçu : 23 juin 2022

Accepté : 06 octobre 2022

Publié: 26 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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Journal du paludisme (2023)

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